Design und Charakterisierung eines Proteinfaltungsnetzwerks

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 431 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Um besser zu verstehen, wie die Aminosäuresequenz die Proteinstruktur kodiert, haben wir Mutationswege entwickelt, die drei gemeinsame Faltungen (3α, β-Grasp und α/β-Zopf) verbinden. Die Strukturen von Proteinen an Kreuzungen mit hoher Sequenzidentität in den Pfaden (Knoten) wurden mithilfe von NMR-Spektroskopie bestimmt und auf Stabilität und Funktion analysiert. Um Knoten zu erzeugen, wird die Aminosäuresequenz, die eine kleinere Falte kodiert, in die Struktur einer etwa 50 % größeren Falte eingebettet und eine neue Sequenz entworfen, die mit zwei Sätzen nativer Interaktionen kompatibel ist. Dadurch entstehen Proteinpaare mit einer 3α- oder β-Grifffalte in der kleineren Form, aber einer α/β-Zopffalte in der größeren Form. Darüber hinaus führt die Einbettung kleinerer antagonistischer Falten zu kritischen Zuständen in den größeren Falten, so dass einzelne Aminosäuresubstitutionen sowohl deren Faltung als auch Funktion verändern können. Die Ergebnisse helfen, die zugrunde liegende Mehrdeutigkeit im Proteinfaltungscode zu erklären und zeigen, dass sich durch abrupten Faltungswechsel neue Proteinstrukturen entwickeln können.

In jüngster Zeit gab es bemerkenswerte Fortschritte bei der Fähigkeit, die Tertiärstruktur eines Proteins anhand seiner primären Aminosäuresequenz vorherzusagen1,2 sowie Aminosäuresequenzen zu entwerfen, die stabile, einzigartige Proteinstrukturen kodieren3. Es ist jedoch auch allgemein bekannt, dass einige Proteine dazu neigen, zwei völlig unterschiedliche, aber wohlgeordnete Konformationen einzunehmen4,5,6,7,8,9,10,11,12. Ein besserer Einblick in die Mehrdeutigkeit des Proteinfaltungscodes würde zu einem besseren Verständnis darüber führen, wie sich Proteine entwickeln, wie Mutationen mit Krankheiten zusammenhängen und wie Funktionen mit Sequenzen unbekannter Struktur verknüpft werden können13,14,15,16,17,18, 19,20,21,22,23,24,25,26,27. Wenn der Proteinfaltungscode wirklich verstanden würde, wäre es möglich, Proteine vorherzusagen und zu entwerfen, die tiefgreifende Konformationsänderungen durchlaufen. Es wurden erhebliche Fortschritte beim Verständnis natürlicher Proteine, die die Faltung umschalten,11 und bei der Vorhersage natürlicher Faltungsumschaltungsproteine anhand von Aminosäuresequenzdaten erzielt25. Das Design von Proteinen an der Grenzfläche zwischen verschiedenen Faltungen war möglich7,28,29,30, stellt aber immer noch eine gewaltige Herausforderung dar. Es war eine besondere Herausforderung, monomere Proteine zu entwerfen, die ihre Faltung wechseln, ohne dass sich die Quartärstruktur ändert, und es bedarf eines besseren Verständnisses darüber, wie eine sehr begrenzte Untergruppe von Wechselwirkungen innerhalb des Proteins das Gleichgewicht von einer Faltung und Funktion zur anderen beeinflussen kann29,31, 32.

Unser Ziel bestand hier darin, monomere Proteine zu konstruieren, die sich in einem kritischen Zustand zwischen zwei unterschiedlichen Faltungen befinden. Zu diesem Zweck haben wir drei gut untersuchte Proteinfaltungen ausgewählt und eine Reihe von Sequenzen entworfen, sodass jede Sequenz mit zwei Sätzen nativer Wechselwirkungen kompatibel ist. Zwei dieser Falten stammen vom Streptokokken-Protein G, das zwei Arten von Domänen enthält, die an Serumproteine im Blut binden: Die GA-Domäne bindet an menschliches Serumalbumin (HSA)33,34 und die GB-Domäne bindet an die konstante (Fc)-Region von IgG35,36. Das dritte Protein ist S6, ein Bestandteil der ribosomalen 30S-Untereinheit von Thermus thermophilus37,38,39,40,41. Der Einfachheit halber wird die S6-Faltung als S-Faltung, die GA-Faltung als A-Faltung und die GB-Faltung als B-Faltung bezeichnet. Diese Proteine weisen keine signifikante Sequenzhomologie auf und sind repräsentativ für drei der zehn häufigsten Faltungen: Die S-Faltung ist ein Thioredoxin-ähnliches α/β-Geflecht; die A-Falte ist ein Homöodomänen-ähnliches 3α-Helix-Bündel; und die B-Falte ist ein Ubiquitin-ähnlicher β-Griff42.

Abbildung 1 zeigt ein Netzwerk von Sequenzschnittpunkten (Knoten) mit hoher Identität, die die drei Falten verbinden. Die Pfeile in Abb. 1 zeigen ein Netzwerk, das seinen Ursprung in der natürlichen S6-Sequenz hat. Kreise stellen Knoten im Netzwerk dar, an denen strukturelle und/oder funktionale Schalter auftreten. Die SI- und S'I-Knoten sind Verzweigungspunkte und führen über divergierende Sequenzpfade, einer zu einem Knoten mit der A-Falte (S/A) und einer zu einem Knoten mit der B-Falte (S/B). Sich überschneidende Mutationswege führen von S/A zum nativen GA-Protein und von S/B zum nativen GB-Protein. An diesem Schnittpunkt (A/B) geht eine A-Falte in eine B-Falte über.

S6 ist die Ursprungssequenz im Engineering-Prozess. SI und S'I sind separate Knoten und schleifengroße Varianten der S-Faltung, die beide Proteaseinhibitorfunktionen haben. Der SI-Zweig des Mutationspfades führt zu einem Knoten mit der A-Faltung und der HSA-Bindungsfunktion. Der S'I-Zweig des Pfades führt zu einem Knoten mit der B-Faltung und der IgG-Bindungsfunktion. Der S/A-Knoten (blaue und rote Kreise) umfasst die Proteine Sa1, Sa2, A1 und A2. Der S/B-Knoten (blauer und grüner Kreis) umfasst die Proteine Sb3, Sb4, Sb5, B3 und B4. Die A- und B-Pfade selbst kreuzen sich an einem A/B-Knoten (grüne und rote Kreise), an dem A- und B-Falten nahezu isoenergetisch und bifunktional sind. Die S- und S'-Zweige setzen sich fort und verbinden sich mit vielen anderen natürlichen Sequenzen in der Familie der α/β-Zopf-Superfalten.

Proteine rund um den A/B-Knoten wurden in unserer früheren Arbeit ausführlich charakterisiert29,31,32. Hier stellen wir fest, dass sowohl GA als auch GB in eine dritte Falte (α/β-Zopf) wechseln können und zeigen, dass diese drei Faltungen und vier Funktionen (HSA-Bindung, IgG-Bindung, Proteasehemmung und RNA-Bindung) miteinander verbunden sein können in einem Netzwerk, das entfaltete und funktionslose Zustände vermeidet. Wir beschreiben, wie diese Knoten konstruiert wurden, bestimmen Schlüsselstrukturen mittels NMR-Spektroskopie und analysieren Stabilität und Bindungsfunktion. Die Fähigkeit, Knoten zu entwerfen und zu charakterisieren, die drei häufig vorkommende kleine Faltungen verbinden, legt nahe, dass der Faltungswechsel ein intrinsisches Merkmal des Proteinfaltungscodes sein könnte und für die Entwicklung der Proteinstruktur und -funktion wichtig ist.

Das ribosomale S6-Protein ist strukturell homolog zu Subtilisin-Protease-Inhibitoren, die als Prodomänen bekannt sind (Abb. 2a, b)43,44. Inhibitoren vom Prodomänentyp haben zwei Bindungsoberflächen mit der Protease. Eine Oberfläche umfasst die letzten neun C-terminalen Aminosäuren des Inhibitors, die in der Substratbindungsspalte der Protease binden (Abb. 2b). Eine zweite, dynamischere Oberfläche wird zwischen zwei Subtilisin-Helices und der großen Oberfläche des β-Faltblatts in der α/β-Zopftopologie des Inhibitors gebildet (Abb. 2b)45,46,47. Infolgedessen konnte das S6-Protein in ein Subtilisin-Inhibitorprotein mit derselben Gesamtfaltung (bezeichnet als SI) umgewandelt werden, indem seine neun C-terminalen Aminosäuren durch Reste ersetzt wurden, die für die Bindung in der Substratbindungsspalte von Subtilisin optimiert waren. Dieser Austausch führt zu neuen Kontakten zwischen dem SI-β-Faltblatt und den Subtilisin-Oberflächenhelices (Abb. 2b).

a Struktur des S6-Proteins (gelb), der RNA (hellblau) und der S15- und S18-Proteine (blau) im 30S-Ribosom (PDB 1FKA [https://doi.org/10.2210/pdb1FKA/pdb], Ref. 43 ). Die C-terminalen Aminosäuren von S6 sind in Magenta. b Subtilisin (Weizen) ist im Komplex mit einem Modell des SI-Inhibitors (gelb) dargestellt. Die C-terminalen neun Aminosäuren von SI sind in Magenta dargestellt. Diese Positionen wurden in nativem S6 mutiert, um Affinität für Subtilisin zu erzeugen. Der S'I-Inhibitor (blaugrün) ist ebenfalls mit den veränderten Schleifen in Rot dargestellt. Das bei der Modellierung verwendete Subtilisin war die konstruierte RAS-spezifische Protease. c Das Sa1-Protein (blau und grün) wurde aus SI durch Mutation der 45 Positionen erzeugt (mutierte Seitenketten mit Stäbchen dargestellt). Durch die Deletion C-terminaler Aminosäuren (blau) wird Sa1 in die A-Falte (grün) verschoben. d Das Sb3-Protein (Rosa und Cyan) wurde aus S'I durch Mutation der 67 Positionen erzeugt (mutierte Seitenketten mit Stäbchen dargestellt). Durch die Deletion C-terminaler Aminosäuren (Cyan) oder eine Punktmutation wird Sb3 in eine B-Falte (Rosa) umgewandelt. e Modell von Sa2I (grün und blau), gebunden an Subtilisin (Weizen). Modell von A2 (basierend auf der A1-Struktur), gebunden an HSA (violett). Der HSA-Komplex verwendete PDB 2VDB (Ref. 50) als Vorlage. f Modell von Sb3 (Rosa und Cyan), gebunden an Subtilisin (Weizen). Modell von B4 (Rose) gebunden an Fc (Minze). Der Fc-Komplex verwendete PDB 1FCC (Lit. 51) als Vorlage. Das bei der Modellierung und den Inhibitionsmessungen verwendete Subtilisin war die konstruierte RAS-spezifische Protease PDB 6UAO (Lit. 49).

Das SI-Protein ist 99 Aminosäuren lang und weist eine 10-Reste-Schleife zwischen β2 und β3 auf. Es gibt jedoch viele natürliche Variationen in der Länge der Schleifen in der konservierten α/β-Zopftopologie48. Aus diesem Grund haben wir auch eine 91-Aminosäuren-Version der S-Faltung (als S'I bezeichnet) entwickelt, die der Topologie natürlicher Prodomäneninhibitoren ähnelt (ergänzende Abbildung 1). Insbesondere hat der S'I-Inhibitor eine längere Schleife, die β1 mit α1 verbindet, und eine kürzere Schleife, die β2 mit β3 verbindet (Abb. 2b).

Die SI- und S'I-Proteine wurden durch Bindung an eine Proteasesäule exprimiert und gereinigt49. Die CD-Spektren wurden mit dem nativen S6-Protein verglichen (ergänzende Abbildung 1). Die Inhibitionskonstanten (KI) wurden unter Verwendung einer konstruierten RAS-spezifischen Subtilisinprotease und des Peptidsubstrats QEEYSAM-AMC49 gemessen. SI und S'I hemmen die RAS-spezifische Protease mit KI-Werten von 200 bzw. 60 nM (Ergänzungstabelle 1). Die Einzelheiten des kompetitiven Hemmungstests werden im Abschnitt „Methoden“ beschrieben. Die Ergebnisse zeigen, dass ein ribosomales Protein mit geringfügiger Modifikation (und ohne Faltschalter) in einen Proteaseinhibitor umgewandelt werden kann. Darüber hinaus erleichterten die SI- und S'I-Proteine jedoch auch die Entwicklung nachfolgender Schalter zu neuen Falten und Funktionen, indem sie jede der S-, A- und B-Falten mit leicht messbaren Bindungsfunktionen verknüpften: Proteasehemmung (S oder S' -falten); HSA-Bindung (A-Faltung, Abb. 2e)50; und IgG-Bindung (B-fach, Abb. 2f)51.

In früheren Arbeiten haben wir Sequenzen erstellt, die sowohl A- als auch B-Falten bevölkern, indem wir die A-Sequenz durch die B-Falte fädeln, eine vielversprechende Ausrichtung finden und dann mithilfe der Phagen-Display-Selektion eine Sequenz mit beiden Falten in Einklang bringen29,52, 53. Hier ist der Ansatz konzeptionell ähnlich, mit der Ausnahme, dass wir Rosetta54 als computergestütztes Designtool zum Testen kompatibler Mutationen anstelle von Phagendisplay verwenden. Der Designprozess ist wie folgt:

Fädeln Sie die A- oder B-Sequenz durch die SI- und S'I-Faltentypen.

Identifizieren Sie Ausrichtungen, die die Anzahl katastrophaler Interaktionen minimieren.

Entwerfen Sie Mutationen, um ungünstige Wechselwirkungen in Clustern von 4–6 Aminosäuren mithilfe von Pymol55 aufzulösen und den Energieverbrauch mithilfe von Rosetta-Relax54 zu minimieren.

Optimieren Sie die Proteinstabilität in der S-Faltung, indem Sie Aminosäuren an nicht überlappenden Positionen rechnerisch mutieren. Wiederholen Sie die Energieminimierung und -bewertung mit Rosetta-Relax.

Um die mit dem Computerdesign verbundenen Unsicherheiten zu verringern, bewahren Sie nach Möglichkeit die ursprünglichen Aminosäuren auf.

Es gibt keinen Grund anzunehmen, dass diese Methode optimal ist. Wir wenden lediglich ein praktikables Schema zur Entwicklung von Sequenzen an, die mit zwei Sätzen nativer Interaktionen kompatibel sind, und bewerten dann Struktur, Stabilität und Funktion. Die ersten Entwürfe wurden auf der Grundlage einer Strukturanalyse mit NMR, einer thermodynamischen Analyse der Entfaltung und einer Funktionsanalyse mithilfe von Bindungstests verfeinert, wie unten beschrieben. Alle entworfenen Proteine wurden in E. coli exprimiert und bis zur Homogenität gereinigt, wie im Abschnitt „Methoden“ beschrieben.

Die Ausrichtung der 56 Aminosäuren langen HSA-Bindung, A-Faltung, mit der 99 Aminosäuren langen SI-Faltung und die anschließende Mutation zur Lösung katastrophaler Wechselwirkungen führten zu Niedrigenergie-Schalterkandidaten mit der Bezeichnung Sa1 und A1. Die genaue Sequenz von A1 ist an den Positionen 11–66 in Sa1 eingebettet, sodass die α1-Helices strukturell ausgerichtet sind (Abb. 3a, ergänzende Abb. 2A). Ihre endgültigen Rechenmodelle wurden von Rosetta mithilfe der Relax-Anwendung generiert. Das Relax-Protokoll durchsucht den lokalen Konformationsraum um eine experimentell bestimmte Struktur und wird nur verwendet, um zu bewerten, ob die entworfenen Mutationen innerhalb dieses begrenzten Konformationsraums günstige native Wechselwirkungen aufweisen. Die entworfenen Modelle von Sa1 und A1 weisen im Vergleich zu den jeweiligen entspannten nativen Strukturen eine sehr ähnliche Energie auf (ergänzende Abbildung 3 und Quelldatendateien).

a Sequenzalignment von A1 und Sa1, die über die 56 Aminosäuren lange A-Region zu 100 % identisch sind. b Überlagerte zweidimensionale 1H-15N-HSQC-Spektren von Sa1 (schwarz) und A1 (rot) mit Rückgrat-Amid-Zuordnungen. Die Spektren wurden bei 25 bzw. 5 °C aufgenommen. c Ensemble aus 10 CS-Rosetta-Strukturen mit der niedrigsten Energie für A1 (linkes Feld). Überlagerung der A1-Struktur (grün) mit der übergeordneten GA-Falte (orange) (rechtes Feld). d Ensemble aus 10 CS-Rosetta-Strukturen mit der niedrigsten Energie für Sa1 (linkes Feld). Überlagerung von Sa1 (grün) mit der übergeordneten S6-Falte (orange) (rechtes Feld). e Rückgratdynamik in entworfenen Proteinen. Diagramm der stationären heteronuklearen NOE-Werte von {1H}-15N bei 600 MHz gegen den Rest für A1 (rot) und für Sa1 (schwarz). Jeder Satz heteronuklearer NOEs wurde aus einem einzigen Experiment erhalten. Fehler wurden anhand des gemessenen Hintergrundgeräuschpegels geschätzt.

Insgesamt ist die 3α-helikale Bündeltopologie von A1 der GA-Grundstruktur, von der sie abgeleitet wurde, sehr ähnlich. Die sequenzspezifischen chemischen Verschiebungszuordnungen für A1 (Abb. 3b) wurden verwendet, um eine 3D-Struktur mit CS-Rosetta zu berechnen (Abb. 3c, Tabelle 1). Unsere früheren Studien zeigten eine enge Übereinstimmung von CS-Rosetta- und De-novo-Strukturen für A- und B-Faltungen mit hoher Sequenzidentität57. Die N-terminalen Reste 1–4 und die C-terminalen Reste 53–56 sind in der Struktur ungeordnet, was mit den stationären heteronuklearen NOE-Daten von {1H}-15N übereinstimmt (Abb. 3e). Ebenso hat Sa1 insgesamt die gleiche βαββαβ-Topologie wie die übergeordnete S6-Struktur (Abb. 3d, Tabelle 2). Die chemischen Verschiebungen des Rückgrats (Abb. 3b) wurden in Kombination mit Hauptketten-Interprotonen-NOEs (ergänzende Abb. 4) verwendet, um eine dreidimensionale Struktur unter Verwendung von CS-Rosetta (PDB 7MN1) zu bestimmen. Das Konformationsensemble zeigt wohldefinierte Elemente der Sekundärstruktur an den Resten 2–10 (β1), 16–32 (α1), 40–44 (β2), 59–67 (β3), 73–81 (α2) und 86 –92 (β4). Der Hauptunterschied zur nativen Struktur besteht darin, dass der β2-Strang in Sa1 sieben Aminosäuren kürzer ist als in S6. Heteronukleare NOE-Daten zeigen eine allgemeine Übereinstimmung mit der Struktur, was darauf hinweist, dass die lange Schleife zwischen den β2- und β3-Strängen der Reste 45–58 flexibler ist als andere interne Regionen der Polypeptidkette (Abb. 3e).

Obwohl die 56-Aminosäuresequenz von A1 zu 100 % mit den Resten 11–66 von Sa1 identisch ist, unterliegt ein erheblicher Teil des Rückgrats Veränderungen zwischen den beiden Strukturen. Während die α1-Helices in A1 und Sa1 eine ähnliche Länge aufweisen, bilden die Regionen, die den α2- und α3-Helices von A1 entsprechen, die β2- und β3-Stränge von Sa1 (Abb. 4a). Kernaminosäuren in der α1-Helix von A1 entsprechen Resten, die auch zum Kern von Sa1 beitragen. Die α1-Helix in Sa1 kontaktiert jedoch einen fast völlig anderen Satz von Resten (Abb. 4b). Beispielsweise haben die Aminosäuren L51, Y53 und I55 im C-terminalen Schwanz von A1 keinen umfassenden Kontakt mit α1, aber die entsprechenden Reste in Sa1 (L61, Y63 und I65) bilden als Teil des Kerns enge Wechselwirkungen mit α1 β3-Strang. Die meisten anderen Kernreste, die die α1-Helix von Sa1 kontaktieren, liegen außerhalb der 56-Aminosäuren-Region, die für die A1-Faltung kodiert. Dazu gehören F4, V6, I8 und L10 vom β1-Strang; A67 vom β3-Strang; V72, L75 und L79 aus der α2-Helix; und V85 aus der Schleife zwischen der α2-Helix und dem β4-Strang. Zwei zusätzliche Reste, V88 und V90 (β4), tragen ebenfalls erheblich zum Kern bei, stehen jedoch nicht mit α1 in Kontakt. Abgesehen von der ursprünglichen topologischen Ausrichtung der α1-Helices überlappen sich die Kerne der 3α- und α/β-Zopffalten daher weitgehend nicht. Insgesamt sind etwa die Hälfte der am Sa1-Kern beteiligten Reste in der A1-Sequenz nicht vorhanden.

a Hauptkettenvergleiche. (Linkes Feld) CS-Rosetta-Struktur von A1 mit Farbcodierung für sekundäre Strukturelemente. (Rechtes Feld) Entsprechende farbcodierte Regionen, abgebildet auf die CS-Rosetta-Struktur von Sa1, veranschaulichen Änderungen in der Rückgratkonformation. Regionen außerhalb der 56-Aminosäuren-Sequenz von A1 sind in Weizen dargestellt. b Seitenkettenvergleiche. (Linkes Feld) Reste, die zum Kern von A1 aus der α1-Helix (gelb) und aus anderen Regionen (cyan) beitragen. Die Nicht-α1-Kernreste von Sa1 (rosa) überlappen nicht mit dem A1-Kern (weitere Einzelheiten siehe Text). (Rechtes Feld) Reste, die zum Kern von Sa1 aus der α1-Helix beitragen (gelb), und die meisten anderen beteiligten Kernreste (rosa). Die Nicht-α1-Kernreste von A1 sind ebenfalls dargestellt (Cyan), was den geringen Grad der Überlappung hervorhebt.

Für Sa1 und A1 wurden Fern-UV-CD-Spektren gemessen und ihre thermischen Entfaltungsprofile durch Messung der Elliptizität bei 222 nm gegenüber der Temperatur bestimmt (Abb. 5 und ergänzende Abb. 5). Sa1 hat eine TM von ~100 °C und eine geschätzte ∆G-Faltung von –5,3 kcal/mol bei 25 °C (Abb. 5b, Ergänzungstabelle 1)58. Die ∆G-Faltung des übergeordneten S6 beträgt −8,5 kcal/mol40. Die Rosetta-Energie des Sa1-Designs ähnelt der der nativen Sequenz (ergänzende Abbildung 3). A1 hat eine TM von 65 °C und eine ∆G-Faltung = −4,0 kcal/mol bei 25 °C58 (Abb. 5a, Ergänzungstabelle 1). Die ∆G-Faltung des übergeordneten GA beträgt −5,6 kcal/mol59,60. Die Rosetta-Energie des A1-Designs ist etwas günstiger als für die native Sequenz (ergänzende Abbildung 3).

ein Diagramm der Elliptizität bei 222 nm gegen die Temperatur für A- und B-Variationen. b Diagramm der Elliptizität bei 222 nm gegen die Temperatur für S-Variationen. Sb0 ist eine Variante von Sb1 mit geringer Stabilität (F7V), die zur Messung der Temperaturabhängigkeit des entfalteten Zustands verwendet wird. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Die anfängliche Konstruktion des Klappschalters erfolgte ohne Rücksicht auf die Erhaltungsfunktion. Infolgedessen weist A1 keine nachweisbare HSA-Bindungsaffinität auf, da zwei Aminosäuren in der Bindungsschnittstelle mutiert waren. Eine signifikante HSA-Bindung wird jedoch wiederhergestellt, wenn die Oberflächenmutationen E28Y und K29Y in A1 (als A2 bezeichnet) erzeugt werden. Diese Mutationen scheinen die Struktur von A1 nicht zu beeinflussen (ergänzende Abbildung 5), führen jedoch zu einer HSA-Bindung von KD ≤ 1 µM (ergänzende Tabelle 1). Dies wurde durch Messung der Bindung an immobilisiertes HSA bestimmt, wie im Abschnitt „Methoden“ beschrieben.

Sa1 bindet keine Protease, da C-terminale Aminosäuren bei seinem Design nicht erhalten blieben. Es kann jedoch in einen Proteaseinhibitor umgewandelt werden, indem seine drei C-terminalen Aminosäuren (AAD) durch DKLYRAL (bezeichnet als Sa1I) ersetzt werden. Es wurde auch eine Version von Sa1I hergestellt, die die exakte 56 Aminosäuren lange A2-Sequenz enthält, indem E38Y- und K39Y-Mutationen vorgenommen wurden (bezeichnet als Sa2I). Sa1, Sa1I und Sa2I weisen laut CD-Analyse eine ähnliche Struktur auf (ergänzende Abbildung 5). Die Hemmkonstante von Sa2I mit dem manipulierten Subtilisin wurde auf 50 nM bestimmt, wie im Abschnitt „Methoden“ (Ergänzungstabelle 1) beschrieben. Somit kann eine stabile A-Falte mit HSA-Bindungsfunktion in eine 99 Aminosäuren lange S-Falte mit Proteaseinhibitorfunktion eingebettet werden (Abb. 2c, e). Es ist zu beachten, dass alle HSA-Kontaktaminosäuren sowohl in der A2- als auch in der Sa2I-Sequenz erhalten bleiben, die dreidimensionale Topologie, die zur Bildung der HSA-Kontaktoberfläche erforderlich ist, jedoch nur in der A-Faltung auftritt50. Dennoch wurde beobachtet, dass Sa2I schwach an HSA bindet (KD ~ 100 µM, Ergänzungstabelle 1). Diese schwache Affinität legt nahe, dass einige Sa2I-Moleküle die 3α-Faltung besiedeln könnten, obwohl die α/β-Zopffalte stark vorherrscht.

Beim Entwurf eines S-zu-B-Faltschalters haben wir zwei topologische Ausrichtungen verwendet. Die erste befand sich zwischen SI- und B-Falten, wo die β1-Stränge jeder Falte ausgerichtet waren (Ergänzende Abbildungen 2B und 6A). Die zweite Ausrichtung erfolgte zwischen S'I- und B-Faltungen, wobei die lange Schleife zwischen β2 und β3 in SI in S'I verkürzt wurde, um besser mit natürlichen Proteaseinhibitoren übereinzustimmen. In diesem Schema wurde die α1β3β4-Topologie der B-Faltung an der α1β2β3-Topologie der S'I-Faltung ausgerichtet (Abb. 6a, ergänzende Abb. 2C).

a Sequenzalignment von B4 und Sb3, die sich um einen Rest (L5Y) über die 56 Aminosäuren lange B-Region unterscheiden. b Überlagerte zweidimensionale 1H-15N-HSQC-Spektren von Sb3 (schwarz) und B4 (rot) mit Rückgrat-Amid-Zuordnungen. Die Spektren wurden bei 25 °C aufgenommen. Der A56-Peak ist ein Alias-Signal. Mit einem Sternchen gekennzeichnete Peaks nehmen mit abnehmender B4-Konzentration an relativer Intensität ab, was auf das Vorhandensein eines schwach assoziierten mutmaßlichen Dimers zusätzlich zum Monomer hinweist. c Ensemble aus 10 CS-Rosetta-Strukturen mit der niedrigsten Energie für B4 (linkes Feld). Überlagerung der B4-Struktur (grün) mit der übergeordneten GB-Falte (orange) (rechtes Feld). d Ensemble aus 10 CS-Rosetta-Strukturen mit der niedrigsten Energie für Sb3 (linkes Feld). Überlagerung von Sb3 (grün) mit der übergeordneten S6-Falte (orange) (rechtes Feld). e Diagramm der stationären heteronuklearen NOE-Werte von {1H}-15N bei 600 MHz gegen den Rest für B4 (rot) und Sb3 (schwarz). Jeder Satz heteronuklearer NOEs wurde aus einem einzigen Experiment erhalten. Fehler wurden anhand des gemessenen Hintergrundgeräuschpegels geschätzt.

Im ersten Ansatz führte die Ausrichtung der β1-Stränge der B-Faltung und der S-Faltung und die anschließende Mutation zur Lösung katastrophaler Wechselwirkungen zu Niedrigenergie-Schalterkandidaten mit der Bezeichnung B1 und Sb1. Die genaue Sequenz von B1 ist in Sb1 an den Positionen 4–59 eingebettet (ergänzende Abbildung 6A). Die Rechenmodelle von B1 und Sb1 zeigen im Vergleich zu den entsprechenden entspannten nativen Strukturen relativ geringe Energiezuwächse (ergänzende Abbildung 3). Die NMR-Struktur von B1 zeigte eine ββαββ-Topologie, die mit der der übergeordneten B-Faltung identisch war, mit einem Grundgerüst-RMSD von ~ 0,6 Å (ergänzende Abbildung 6B, C). Die Topologie von Sb1 ist jedoch nicht dieselbe wie die der übergeordneten S6-Struktur und weist stattdessen eine ähnliche Faltung wie B1 auf (Ergänzende Abbildungen 6B, D und 7, PDB 7MQ4). Durch die Einführung von 13 Mutationen in Sb1 entstand ein Protein mit der Bezeichnung Sb2 (ergänzende Abbildung 8). Sb2 enthält vier β-Stränge und zwei α-Helices und weist die allgemeinen Merkmale der übergeordneten S-Faltung auf (Ergänzende Abbildung 9, PDB 7MN2). Die 56-Aminosäuren-Version von Sb2 (als B2 bezeichnet) hat jedoch eine deutlich höhere Rosetta-Energie als B1 und ist vermutlich entfaltet (ergänzende Abbildung 3). Daher führten weder die B1/Sb1- noch die B2/Sb2-Proteinpaare zu Sequenzen mit hoher Identität und unterschiedlichen Faltungen. Dennoch ist B1 zu 80 % identisch mit der entsprechenden eingebetteten Region im S-gefalteten Protein Sb2 (ergänzende Abbildung 9A). Die Strukturen von B1, Sb1 und Sb2 werden im Anhang und in den Tabellen 1 und 2 näher beschrieben.

Um das Design des S-zu-B-Schalters zu verbessern, haben wir die B-Falte an der S'-Inhibitorfalte ausgerichtet und eine Ausrichtung gewählt, die eine topologische Übereinstimmung zwischen α1β3β4 in B und α1β2β3 in S' herstellt (ergänzende Abbildung 2C). Eine Mutation zur Auflösung schädlicher Wechselwirkungen in dieser Ausrichtung führte zu niederenergetischen Schalterkandidaten mit der Bezeichnung B3 und Sb3 (ergänzende Abbildung 10). Die genaue Sequenz von B3 ist in Sb3 an den Positionen 1–56 eingebettet. Die Energie des Rechenmodells für Sb3 ist etwas günstiger als die entspannte native Struktur. Das entworfene Modell von B3 zeigt im Vergleich zur entspannten nativen Struktur relativ geringe Energiezuwächse (ergänzende Abbildung 3).

Die NMR-basierte Strukturbestimmung zeigte, dass Sb3 eine βαββαβ-Sekundärstruktur und eine S-fache Topologie aufweist (Abb. 6a, b, d, PDB 7MP7). Geordnete Regionen entsprechen den Resten 4–10 (β1), 24–37 (α1), 42–46 (β2), 51–56 (β3), 62–70 (α2) und 79–85 (β4). Ein Vergleich von Sb3 mit der übergeordneten S-Faltung zeigt, dass der β1/α2/β4-Anteil der Falte in beiden Fällen ähnlich ist. Im Gegensatz dazu ist die β1–α1-Schleife in Sb3 länger (13 Reste) als in der übergeordneten S-Faltung (5 Reste), während α1, β2, die β2–β3-Schleife und β3 alle kürzer als in der übergeordneten Falte sind (Abb . 6d). In Übereinstimmung mit der Sb3-Struktur ist die 13 Aminosäuren lange β1-α1-Schleife äußerst flexibel (Abb. 6e). Wir exprimierten und reinigten auch ein verkürztes Protein, das der eingebetteten B-Faltung entspricht, der 56-Aminosäuren-Version von Sb3 (bezeichnet als B3). Das 2D-1H-15N-HSQC-Spektrum von B3 bei 5 °C und niedrigen Konzentrationen (<20 μM) stimmte mit einer vorherrschenden, monomeren B-Faltung überein (ergänzende Abbildung 11), zeigte jedoch eine signifikante Austauschverbreiterung bei 25 °C, was auf eine niedrige Konzentration hinweist Stabilität (siehe unten). Vermutlich ist die geringe Stabilität auf die ungünstigere Packung von Y5 im Kern der B-Falte im Vergleich zu einem kleineren aliphatischen Leucin zurückzuführen. Es waren jedoch auch weitere, mutmaßlich oligomere Arten vorhanden, deren relative Peakintensitäten mit zunehmender Proteinkonzentration anstiegen. Aufgrund seiner relativ geringen Stabilität und Probenheterogenität wurde B3 nicht weiter strukturell analysiert.

Wir haben die NMR-Struktur von Sb3 verwendet, um eine Punktmutation, Tyrosin 5 zu Leucin (Y5L), zu entwerfen, die die eingebettete B-Falte stabilisieren würde, ohne die nativen Kontakte in der S-Falte zu beeinträchtigen (ergänzende Abbildung 10). Es wurde daher erwartet, dass dieser Mutant die Population in die B-Faltung verschiebt. Es wurden zwei Mutanten hergestellt, ein Y5L-Mutant von Sb3 (bezeichnet als Sb4) und ein Y5L-Mutant von B3 (bezeichnet als B4). B4 ist tatsächlich stabiler als B3 (Abb. 5a, Ergänzungstabelle 1). Die Zuordnung und Strukturbestimmung von B4 zeigte, dass seine Topologie mit der der übergeordneten B-Falte identisch ist (Abb. 6b, c). Bei Konzentrationen über 100 μM zeigte B4 eine ähnliche Tendenz zur schwachen Selbstassoziation wie B3. Für Sb4 zeigte das HSQC-Spektrum etwa doppelt so viele Amid-Kreuzpeaks wie für Sb3 (Abb. 7a), was darauf hindeutet, dass S- und B-Zustände gleichzeitig besetzt waren. Dies wurde durch die NMR-Zuordnung und auch einen Vergleich der HSQC-Spektren für Sb4, B4 und Sb3 bestätigt. Ein erheblicher Teil der Amidsignale des Sb4-Rückgrats (~ 50 Peaks) stimmte weitgehend mit denen von B4 überein, was auf das Vorhandensein eines B-Zustands hinweist (ergänzende Abbildung 12A – C). Die enge Übereinstimmung dieser Peaks ist vermutlich darauf zurückzuführen, dass die Reste 1–56 im B-Zustand von Sb4 in ihrer Sequenz mit B4 identisch sind. Die größten Störungen der Amidverschiebung zwischen dem B-Zustand von Sb4 und B4 treten bei Resten auf, die proximal zum C-Terminus der B-Faltung liegen, wie etwa G41, wo Sb4 zusätzliche Reste aufweist und B4 nicht. Viele der Sb4-Signale stimmten auch gut mit Sb3 überein, obwohl der Grad der Ähnlichkeit nicht so groß war wie bei B4 (Ergänzende Abbildung 12D – F). Größere Unterschiede in der chemischen Verschiebung der Amide zwischen dem S-Zustand von Sb4 und Sb3 sind wahrscheinlich auf die Y5L-Mutation zurückzuführen, bei der es sich um eine relativ große Veränderung neben dem Kern handelt. Um diese Unklarheiten zu beseitigen, wurden Rückgratresonanzzuordnungen für den S-Zustand von Sb4 vorgenommen (Abb. 7a, [https://doi.org/10.13018/BMR51719], Einzelheiten finden Sie im Abschnitt „Methoden“). Ein Vergleich der S-Zustandszuordnungen von Sb4 mit Sb3 zeigte, dass die meisten größeren Amidverschiebungsstörungen in den β1- und β4-Strängen auftraten. Die Analyse der Sekundärverschiebung zeigte, dass das Muster der Sekundärstrukturelemente für den S-Zustand von Sb4 dem von Sb3 ähnelt (Abb. 7b). Die Interprotonen-NOE-Analyse ergab, dass auch die Anordnung der β-Stränge ähnlich ist (Abb. 7c). Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass Sb4 bei 25 °C sowohl die S- als auch die B-Faltung ungefähr gleichermaßen bevölkert. Darüber hinaus zeigte ein ZZ-Austauschspektrum, dass sich die S- und B-Zustände von Sb4 auf der NMR-Zeitskala in einem langsamen Konformationsaustausch befinden (Abb. 7d).

a Zweidimensionale 1H–15N-HSQC-Spektren von Sb4 (links), B4 (Mitte) und Sb3 (rechts) bei 25 °C. Im Sb4-Spektrum sind die Rückgrat-Amid-Resonanzzuordnungen für den S-Zustand (blau) und den B-Zustand (rot) dargestellt. b Konfidenzniveaus geordneter Sekundärstrukturbereiche für den S-Zustand von Sb4 bei 30 °C (rot) und für Sb3 bei 25 °C (grau) aus chemischen Verschiebungen unter Verwendung von TALOS-N. Die aus der dreidimensionalen Struktur ermittelten Sekundärstrukturelemente von Sb3 sind oberhalb des Diagramms dargestellt. c Zusammenfassung der weitreichenden Rückgrat-NOEs aus 3D-15N-NOESY-Daten für Sb3 bei 25 °C (schwarz) und den S-Zustand von Sb4 bei 30 °C (rot). d Gly41-Bereich des 300-ms-ZZ-Austauschspektrums für Sb4 bei 25 °C, der Austauschpeaks zwischen den S- und B-Zuständen zeigt.

Schließlich haben wir eine Mutation von Leucin 67 zu Arginin (L67R) in Sb4 entworfen, um die S-Faltung zu destabilisieren, ohne die Sequenz der eingebetteten B-Faltung zu ändern. Der Mutant wird als Sb5 bezeichnet (Ergänzende Abbildung 10). Es wurde erwartet, dass dies zu einer Verlagerung der Population in die B-Falte führen würde. Das 2D-1H-15N-HSQC-Spektrum von Sb5 weist darauf hin, dass die L67R-Mutation tatsächlich die S-Faltung destabilisiert, mit dem Verlust von Amid-Kreuzpeaks vom S-Typ und dem gleichzeitigen Auftreten eines neuen Satzes von Signalen, die auf einen Wechsel zu einer B-Faltung hinweisen. falten. Die Überlagerung des Spektrums von Sb5 mit dem von B4 zeigt, dass die neuen Signale in Sb5 weitgehend mit dem Spektrum von B4 übereinstimmen (Ergänzende Abbildung 13). Somit verschiebt die L67R-Mutation das Gleichgewicht von der S-Faltung zur B-Faltung. Die zusätzlichen Signale (~25–30) im zentralen Bereich des HSQC-Spektrums, die in B4 nicht erkannt werden, sind vermutlich auf den ungeordneten C-terminalen Schwanz von Sb5 zurückzuführen. Der C-terminale Schwanz von Sb5 scheint nicht umfassend mit der B-Falte zu interagieren, was durch wenige Änderungen der chemischen Verschiebungen oder Peakintensitäten in der B-Region von Sb5 im Vergleich zu B4 belegt wird.

Die ausgerichteten Aminosäuren 1–56 von Sb3 und B4 weisen eine Sequenzidentität von 98 % auf, der einzige Unterschied besteht in einer L5Y-Mutation in Sb3 (Abb. 6a). Die globalen Falten von Sb3 und B4 weisen jedoch große Unterschiede auf (Abb. 8a, ergänzende Abb. 4). Die β1-Stränge sind zwar ähnlich lang, in Sb3 und B4 jedoch in entgegengesetzte Richtungen. Der β1-Strang bildet eine parallelsträngige Wechselwirkung mit β4 in B4, jedoch eine antiparallele Wechselwirkung mit dem entsprechenden β3-Strang in Sb3. Während die Reste 9–20 die aus sechs Resten bestehende β1–β2-Schleife und den aus sechs Resten bestehenden β2-Strang von B4 bilden, bilden dieselben Aminosäuren das Ende von β1 und 10 Reste der weitgehend ungeordneten β1–α1-Schleife in Sb3. Der Rest der B-Region ist topologisch ähnlich, wobei die α1/β3/β4-Struktur in B4 mit der α1/β2/β3-Struktur in Sb3 übereinstimmt. Insgesamt ist die Reihenfolge der H-Brücken in den 4-strängigen β-Faltblättern jedoch recht unterschiedlich, mit β2β3β1β4 in Sb3 und β3β4β1β2 in B4.

a Hauptkettenvergleiche. (Linkes Feld) CS-Rosetta-Struktur von B4 mit farbcodierten Sekundärstrukturelementen. (Rechtes Feld) Entsprechende farbcodierte Regionen, die auf die CS-Rosetta-Struktur von Sb3 abgebildet sind und Änderungen in der Rückgratkonformation zeigen. Regionen außerhalb der 56-Aminosäuren-Sequenz von B4 sind in Weizen dargestellt. b Seitenkettenvergleiche. (Linkes Feld) Rückstände, die zum Kern von B4 aus α1/β3/β4 (gelb) und aus anderen Regionen (cyan) beitragen. Die Nicht-α1/β2/β3-Kernreste von Sb3 (rosa) überlappen nicht mit dem B4-Kern (weitere Einzelheiten siehe Text). (Rechtes Feld) Reste, die zum Kern von Sb3 aus α1/β2/β3 beitragen (gelb), und die anderen beteiligten Kernreste (rosa). Die Nicht-α1/β2/β3-Kernreste von B4 sind ebenfalls dargestellt (Cyan). Der einzelne L5Y-Aminosäureunterschied zwischen B4 und Sb3 ist hervorgehoben.

Die Hauptkernreste von B4 bestehen aus Y3, L5, L7 und L9 von β1, A26, F30 und A34 von α1 sowie F52 und V54 von β4 (Abb. 8b). In Sb3 sind die topologisch äquivalenten Regionen des Kerns A26, F30 und A34 von α1 sowie F52 und V54 von β3. Die Reste Y5, L7 und L9 des β1-Strangs von Sb3 sind ebenfalls Teil des Kerns, weisen jedoch aufgrund der umgekehrten Ausrichtung von β1 eine andere Packung als B4 auf. Die Reste A12 und A20, die zur Peripherie des Kerns in B4 beitragen, sind in der β1-α1-Schleife von Sb3 lösungsmittelzugänglich. Die meisten verbleibenden Kernreste von Sb3 stammen von außerhalb der B-Region und umfassen Aminosäuren von β3 (A56), α2 (V64, L67, A68, L71) und β4 (V80 und I82).

Fern-UV-CD-Spektren wurden für B3, B4, Sb3, Sb4 und Sb5 gemessen und ihre thermischen Entfaltungsprofile wurden durch Messung der Elliptizität bei 222 nm gegenüber der Temperatur bestimmt (Abb. 5, ergänzende Abb. 10, ergänzende Tabelle 1). Wie oben beschrieben, ist die vorherrschende Form von Sb3 eine S-Faltung. CD- und NMR-Analysen zeigen, dass B3 überwiegend eine B-Faltung mit einer ∆G-Faltung von −1,2 kcal/mol bei 25 °C ist58. Aus der NMR-Analyse geht hervor, dass die B-Faltung im Gleichgewicht mit mutmaßlich dimeren Zuständen steht. Dadurch entsteht eine Situation, in der die B-Faltung sowohl temperaturabhängig als auch konzentrationsabhängig ist. Die vorherrschende Form bei 5 °C und ≤18 µM ist jedoch die B-Faltung. Die geringe Stabilität und das konzentrationsabhängige Verhalten von B3 könnten darauf hindeuten, dass eine gewisse Neigung zu S-Typ-Konformationen im 56-Reste-Protein bestehen bleiben könnte.

Sb4 hat ein Temperaturentwicklungsprofil, das Sb3 sehr ähnlich ist (Abb. 5), obwohl sowohl S- als auch B- bei 25 °C in Sb4 ungefähr gleich stark besiedelt sind (Abb. 7). Dies zeigt, dass die Y5L-Mutation zu zwei Faltungen führt, die nahezu isoenergetisch und beide im Vergleich zum entfalteten Zustand thermodynamisch stabil sind. Da sich S- und B-Falte im Gleichgewicht befinden und ungefähr gleich besiedelt sind, beträgt die freie Energie des Wechsels von der S-Falte zur B-Falte (∆GB-Faltung/S-Faltung) bei 25 ~0 kcal/mol °C. Das Schaltergleichgewicht spiegelt den Einfluss der antagonistischen B-Faltung auf die S-Faltungspopulation in Sb4 wider, wobei das Leucin am Rest 5 zur Stabilisierung des alternativen B-Zustands auf Kosten des S-Zustands beiträgt. Die thermische Denaturierung durch CD zeigt, dass B4 bei 25 °C eine ∆G-Faltung von −4,1 kcal/mol aufweist58. Das thermische Entfaltungsprofil von Sb5 zeigt einen Tieftemperaturübergang mit einem Mittelpunkt von ~10 °C und einen Hauptübergang mit einem Mittelpunkt von ~60 °C (Abb. 5b). Die NMR-Analyse zeigt, dass der Hauptübergang die Entfaltung der B-Falte ist. Somit macht das Arginin bei 67 in Sb5 die B-Faltung günstiger, indem es die S-Faltung ungünstig macht, was mit der durch NMR beobachteten Veränderung der Population von gemischt zur B-Faltung übereinstimmt.

Das Sb3-Protein ist eng mit S'I verwandt, verfügt jedoch nicht über eine Inhibitorfunktion, da die C-terminalen Aminosäuren im Design des Schalters geändert wurden. Es kann jedoch in einen Proteaseinhibitor umgewandelt werden, indem die C-terminalen Aminosäuren VTE in DKLYRAL umgewandelt werden. Dieser Mutant wird als Sb3I bezeichnet. Sb3 und Sb3I scheinen laut CD-Analyse eine ähnliche Struktur zu haben (ergänzende Abbildung 10). Der KI für Sb3I mit dem manipulierten Subtilisin wurde zu 50 nM bestimmt (Ergänzungstabelle 1).

Die Bindung an IgG wurde für B3 und Sb3I bestimmt (Ergänzungstabelle 1). B3 und Sb3I banden an IgG-Sepharose mit KD ≤ 1 µM bzw. 10 µM. Vermutlich weist Sb3I eine signifikante IgG-Bindungsaktivität auf, da die α1β3-IgG-Bindungsoberfläche der B-Falte in der S-Falte weitgehend erhalten bleibt. Somit ist Sb3I ein Doppelfunktionsprotein mit sowohl IgG-Bindungs- als auch Proteaseinhibitorfunktionen (Abb. 2f).

Das gesamte Netzwerk sich überschneidender Pfade zwischen der S-, A- und B-Faltung ist in Abb. 9 zusammengefasst. Der erste Knoten auf dem Pfad ist ein funktioneller Schalter vom RNA-Bindungsprotein zum Proteaseinhibitor ohne Faltungsschalter. Das α/β-Geflecht ist eine gemeinsame Faltung, und Proteine mit dieser Grundtopologie umfassen viele verschiedene Funktionen42. Die Konstruktion der SI- und S'I-Knoten veranschaulicht, wie mit einigen Mutationen eine Proteaseinhibitorfunktion in der α/β-Zopftopologie entstehen kann. Der Austausch nur C-terminaler Aminosäuren im S6-Protein führt zu einer Interaktion mit der Substratbindungsspalte der Protease (Abb. 2a, b). Diese C-terminale Wechselwirkung und der zufällige Kontakt zwischen der β-Faltblattoberfläche des α/β-Geflechts und zwei α-Helices in der Protease führen zu einer Proteasehemmung im Bereich von 50 nM. Basierend auf der Struktur von S6 im 30S-Komplex hat die C-terminale Modifikation möglicherweise keine wesentlichen Auswirkungen auf die Bindungsinteraktionen mit ribosomaler RNA und dem S15-Protein (Abb. 2a)43. Somit ist der Übergang vom RNA-bindenden Protein zum Proteaseinhibitor wahrscheinlich ununterbrochen. Eine Insertion in die β1–α1-Schleife und eine Deletion in der β2–β3-Schleife im SI-Inhibitor erzeugt eine Topologie, die natürlichen Inhibitoren vom Prodomänentyp ähnlicher ist44,46,61 und erzeugt ein ähnliches α1β2β3-Motiv in der S'-Faltung zum α1β3β4-Motiv der B-Faltung. Diese topologische Ähnlichkeit bringt das S'I näher an einen Schnittpunkt mit der B-Falte. Somit sind SI- und S'I-Knoten sowohl funktionale Schalter als auch Verzweigungspunkte zum Umschalten der S-Falte in die A- bzw. B-Falte.

Wechsel zwischen stabilen Faltungen können durch eine einzelne Aminosäuremutation oder das Löschen/Anhängen einer terminalen Sequenz, die die S-Faltung stabilisiert, induziert werden. Blau steht für eine S-Faltung, Grün für eine B-Faltung und Rot für eine A-Faltung. Graue Pfeile verbinden Proteine, die ohne Faltschalter umgestaltet wurden. Sb4 wird mit zwei Faltungen gleichzeitig beobachtet. Die Strukturen GA98 und GB98 stammen aus den PDB-Codes 2LHC bzw. 2LHD (Ref. 32).

Für die Konstruktion von Knoten an Faltenkreuzungen mussten Sequenzen entworfen werden, die mit nativen Interaktionen in zwei verschiedenen Falten kompatibel sind. Wir haben dazu einfache Regeln verwendet. Die erste Regel bestand darin, Topologien auszurichten, anstatt Sequenzähnlichkeiten zu maximieren. Die Identifizierung einer gemeinsamen Topologie kann dabei helfen, ein Register zu ermitteln, das weniger unüberbrückbare Konflikte aufweist. Beispielsweise erleichterte die topologische Ausrichtung der α1-Helix der SI-Faltung und der α1-Helix der A-Faltung die Konstruktion des Faltungsschalters, da die Regionen, die α1 der SI-Faltung flankieren, zwei verschiedene Faltungsmotive kodieren können. Wenn die topologische Ausrichtung schlecht ist, wie es bei S- und B-Falten der Fall war, war es hilfreich, nach natürlichen Variationen in den Windungen der längeren Falte zu suchen, um eine bessere Ausrichtung zu erreichen. Variationen in Schleifen und Windungen in einer größeren Falte schaffen mehr Gestaltungsfreiheit und eine höhere Wahrscheinlichkeit von Wechseln. Sobald eine Ausrichtung gewählt ist, besteht die Grundregel bei der Lösung katastrophaler Konflikte darin, die ursprünglichen Aminosäuren nach Möglichkeit zu erhalten. Dies reduziert die Unsicherheiten, die mit dem rechnerischen Design verbunden sind. Die Rosetta-Energiefunktion wurde nicht zur Vorhersage einer günstigen Ausrichtung verwendet, war jedoch wichtig bei der Bewertung von Mutationen, um Konflikte aufzulösen, sobald eine Ausrichtung ausgewählt wurde.

Die Auswahl von Mutationen, die mit zwei Sätzen nativer Interaktionen kompatibel sind, erforderte Kompromisse bei der Energetik des nativen Zustands jeder einzelnen Falte 5,11. Ein Knoten kann in Fällen entstehen, in denen beide alternativen Faltungen relativ zum entfalteten Zustand stabil sind. Die Stabilität relativ zum entfalteten Zustand (dh einem Zustand mit geringer Sekundärstruktur) wurde durch CD-Schmelzen bestimmt (Abb. 5). Es war aufschlussreich, die Stabilität sowohl kurzer (56 Reste) als auch längerer Formen einer mutmaßlichen Knotensequenz zu untersuchen. Die unabhängige Stabilität der G-Falte kann in der Kurzform ohne den Antagonismus der S-Falte bestimmt werden, der in der längeren Sequenz vorhanden ist. Die Stabilitäten der A1- und A2-Proteine betragen etwa −4 kcal/mol bei 25 °C58 im Vergleich zu −5,6 kcal/mol für das native GA-Protein56. Die Stabilitäten von B3 und B4 betragen −1,2 bzw. −4,1 kcal/mol bei 25 °C58 im Vergleich zu −6,7 kcal/mol für das native GB-Protein62. Für die längeren Sequenzen beträgt die ∆G-Faltung von Sa1 und Sb3 −5,3 bzw. −3,5 kcal/mol bei 25 °C58 im Vergleich zu −8,5 kcal/mol für das native S6-Protein40.

Bei den S-Falten müssen jedoch auch die energetischen Effekte der stabilen, eingebetteten G-Falte berücksichtigt werden. Da die Gleichgewichte zwischen beiden gefalteten Zuständen und dem entfalteten Zustand thermodynamisch verknüpft sind, wird die freie Energie eines Wechsels von einer S-Faltung zu einer G-Faltung (∆GG-Faltung/S-Faltung) durch die Differenz der ∆G-Faltung angenähert ( ∆∆Gfaltung) zwischen der kurzen und der langen Form eines Knotenproteins. Basierend auf der ∆G-Faltung für A1 und Sa1 beträgt die vorhergesagte ∆GA-Faltung/S-Faltung von Sa1 beispielsweise 1,3 kcal/mol. Dies steht im Einklang mit der durch NMR bestimmten Struktur der vorherrschenden S-Faltung, aber auch mit der kleinen Population der 3α-Faltung, die auf eine schwache HSA-Bindung schließen lässt. Aus den thermischen Denaturierungsprofilen von B3 und Sb3 beträgt die vorhergesagte ∆GB-Faltung/S-Faltung von Sb3 2,3 kcal/mol, ein Wert, der mit der in NMR-Experimenten beobachteten stabilen S-Faltung übereinstimmt. Allerdings nähert sich auch die Sb3-Folge einem kritischen Punkt. Eine Substitution in Sb3, die die B-Faltung (Y5L) stabilisiert, verschiebt das Gleichgewicht von Sb4 zu einer ungefähr gleichen Mischung aus B- und S-Faltungen. Das heißt, die ∆GB-Faltung/S-Faltung von Sb4 beträgt ~0 kcal/mol bei 25 °C. Eine weitere Substitution, die die S-Faltung (L67R) destabilisiert, verschiebt die Population von Sb5 in eine stabile B-Faltung (∆GB-Faltung/S-Faltung ≤ −5 kcal/mol) (Abb. 9).

Die Existenz von Knoten zwischen Falten hat Auswirkungen auf die Entwicklung neuer Funktionen. Im Fall des S/A-Knotens liegen alle Kontaktaminosäuren für HSA innerhalb der S-Faltung des Proteaseinhibitors Sa2I, wenn auch in einer kryptischen Topologie. Die Deletion der Aminosäuren 67–99 (A2) führt zum Verlust der Inhibitorfunktion und zu einem Faltwechsel vom α/β-Geflecht zu 3α. Der Erwerb der HSA-Bindungsaktivität (KD < 1 µM) resultiert aus der Demaskierung der kryptischen HSA-bindenden Aminosäuren über den Faltschalter (Abb. 2e). Dieses Maß an Bindungsaffinität könnte biologisch relevant sein, da die Konzentration von HSA im Serum >500 µM63 beträgt. Im Fall des S/B-Knotens enthält das α1β3-Motiv alle IgG-Kontaktaminosäuren und Sb3I weist eine gewisse Affinität sowohl für IgG (KD = 10 µM) als auch für Protease (KI = 50 nM) auf. In diesem Fall führt die Y5L-Mutation (Sb4) oder eine Deletion von 57–91 (B4) zu einem Fold Switch vom α/β-Geflecht zum β-Griff und führt zu einer stärkeren IgG-Bindung (KD ≤ 1 µM) (Abb. 2f). ). Dieses Maß an Bindungsaffinität könnte auch biologisch relevant sein, da die Konzentration von IgG im Serum >50 µM (oder >100 µM Fc-Bindungsstellen) beträgt64. Wir haben zuvor gezeigt, dass eine A-Falte mit HSA-Bindungsfunktion über einzelne Aminosäuresubstitutionen, die die Faltungen vertauschen und kryptische Kontaktaminosäuren für die beiden Liganden aufdecken, in eine B-Falte mit IgG-Bindungsfunktion umgewandelt werden kann29,32.

Zusammenfassend war es möglich, drei gemeinsame Falten in einem Netzwerk von Knoten mit hoher Identität zu verbinden, die kritische Punkte zwischen zwei Falten bilden. Wie in anderen komplexen Systemen kann eine kleine Veränderung eines Proteins in der Nähe eines kritischen Punktes einen „Schmetterlingseffekt“ auf die Art und Weise haben, wie die Falten besiedelt werden. Diese Eigenschaft des Proteinfaltungscodes bedeutet, dass Proteine mit mehreren Faltungen und Funktionen in höchst identischen Aminosäuresequenzen existieren können. Dies legt nahe, dass die Entwicklung neuer Falten und Funktionen manchmal ununterbrochenen Mutationswegen folgen kann.

Die Mutagenese wurde mit Q5® Site-Directed Mutagenesis Kits (NEB) durchgeführt. GA- und GB-Varianten wurden in einen Vektor (pH0720) kloniert, der die folgende Sequenz kodiert:

MEAVDANSLA QAKEAAIKEL KQYGIGDKYI KLINNAKTVE GVESLKNEIL KALPTEGSGN TIRVIVSVDK AKFNPHEVLG IGGHIVYQFK LIPAVVVDVP ANAVGKLKKM PGVEKVEFDH QYRGL

als N-terminale Fusionsdomäne56. Das Zellwachstum erfolgte durch Autoinduktion29,65. Die Zellen wurden durch 20-minütige Zentrifugation bei 3750 × g geerntet und durch Ultraschallbehandlung auf Eis in 0,1 M KPi, pH 7,2, lysiert. Zelltrümmer wurden durch 15-minütige Zentrifugation bei 10.000 × g pelletiert. Der Überstand wurde durch 30-minütige Zentrifugation bei 45.000 × g geklärt. Die Proteine wurden mithilfe einer zweiten Generation des Affinitätsspaltungs-Tag-Systems gereinigt, das zuvor zur Reinigung von Schalterproteinen eingesetzt wurde29,66. Der Tag der zweiten Generation führt zu einer hochgradigen löslichen Expression der Switch-Proteine und ermöglicht außerdem das Einfangen des Fusionsproteins durch feste Bindung an eine immobilisierte Prozessierungsprotease über die C-terminale EFDHQYRGL-Sequenz. Beladung und Waschen erfolgten mit 5 ml/min für eine 5 ml Im-Prot-Säule unter Verwendung eines Laufpuffers von 20 mM KPi, pH 6,8. Die für eine hohe Reinheit erforderliche Waschmenge hängt von der Klebrigkeit des Zielproteins und davon ab, wie viel davon an der Säule gebunden ist. Wir waschen typischerweise mit 10 Säulenvolumina (CV) Waschlösung, gefolgt von 3 CV 0,5 M NaCl und dann ~10 CV Laufpuffer. Dies kann bei Bedarf wiederholt werden. Die 0,5 M NaCl-Spritzen werden wiederholt, bis die bei jedem Spritzen mit hohem Salzgehalt freigesetzte Absorptionsmenge klein und konstant wird. Die gesamte Lösung mit hohem Salzgehalt wird ausgewaschen, bevor mit der Spaltung begonnen wird. Das Zielprotein wurde von der Im-Prot-Säule durch Injektion von 15 ml Imidazollösung (0,1 mM) mit 1 ml/min und 22 °C abgespalten. Das gespaltene Protein eluiert typischerweise als scharfer Peak bei 2–3 CV. Das gereinigte Protein wurde dann auf 0,2–0,3 mM konzentriert, wie für die NMR-Analyse erforderlich. Die Säulen wurden durch Injektion von 15 ml 0,1 N H3PO4 (0,227 ml konzentrierte Phosphorsäure (85 %) pro 100 ml) mit einer Flussrate von ~1 CV/min regeneriert. Die Waschlösung wurde unmittelbar nach dem Strippen neutralisiert. Das Reinigungssystem ist von Potomac Affinity Proteins erhältlich.

Proteaseinhibitorproteine wurden durch Bindung an Im-Prot-Medien und anschließendes Entfernen des gereinigten Inhibitors mit 0,1 N H3PO4 gereinigt. Die Proben wurden dann sofort durch Zugabe von 1/10 Volumen 1 M K2HPO4 neutralisiert.

Rosetta-Energien aller entworfenen Strukturen wurden mithilfe der Slow Relax-Routine54 erzeugt. Für jedes Design wurden 1000 Täuschkörper berechnet. PDB-Koordinaten und Energieparameter für den Täuschkörper mit der niedrigsten Energie für jedes Design sind als ergänzende Dateien enthalten.

CD-Messungen wurden in 100 mM KPi, pH 7,2 mit einem Jasco-Spektropolarimeter, Modell J-1100, mit einem Peltier-Temperaturregler durchgeführt. Für Proteinkonzentrationen von 3 bzw. 30 µM wurden Quarzzellen mit Schichtdicken von 0,1 und 1 cm verwendet. Die Elliptizitätsergebnisse wurden als mittlere Restelliptizität, [θ], Grad cm2 dmol−1 ausgedrückt. Elliptizitäten bei 222 nm wurden kontinuierlich mit einer Scanrate von 0,5°/min überwacht. Die Reversibilität der Denaturierung wurde durch Vergleich der CD-Spektren bei 20 °C vor dem Schmelzen und nach Erhitzen auf 100 °C und Abkühlen auf 20 °C bestätigt.

Die Affinität der Proteine zu HSA und IgG wurde durch ihre Retention an den immobilisierten Liganden bestimmt. HSA und Kaninchen-IgG wurden durch Reaktion mit NHS-aktivierter Sepharose 4 Fast Flow (Cytiva) gemäß den Anweisungen des Herstellers immobilisiert. Die Konzentration an immobilisiertem HSA betrug 100 µM. Die Konzentration an immobilisiertem IgG betrug 50 µM (dh 100 µM Fc-Bindungsstellen). Im Allgemeinen wurden 0,2 ml einer 5-µM-Lösung des Testproteins mit einer Flussrate von 0,5 ml/min in eine 5-ml-Säule injiziert. Bei der Bestimmung der Bindungsaffinität wird davon ausgegangen, dass sich die Bindung in einem schnellen Gleichgewicht befindet, sodass das Elutionsvolumen proportional zum Anteil des Testproteins ist, das an 100 µM Bindungsstellen gebunden ist. Proteine, die nach 20 Säulenvolumina (CV) vollständig zurückgehalten werden, werden mit einem KD ≤ 1 µM bewertet. Vollständig zurückgehaltene Proteine werden am Ende des Laufs mit 0,1 N H3PO4 von der Säule entfernt.

Die kompetitiven Hemmkonstanten (KI) wurden unter Verwendung des von AnaSpec Inc. erworbenen fluorogenen Peptidsubstrats QEEYSAM-AMC (7-Amino-4-methylcumarin) und einer hochspezifischen, manipulierten Protease namens RASProtease(I)49 bestimmt. Kompetitive Hemmkonstanten (KI) wurden durch Bestimmung der KM (scheinbar) in Gegenwart von 0, 50 und 100 nM jedes Inhibitorproteins gemessen. Die Reaktionen wurden in 100 mM KPi, 10 mM Imidazol, 0,005 % Tween-20, pH 7,0 bei 25 °C mit 1 nM RASProtease(I) durchgeführt. Die zur Bestimmung von KM und KM(scheinbar) verwendeten QEEYSAM-AMC-Konzentrationen betrugen 0,1, 0,5, 1, 2, 5 und 10 µM. Die anfänglichen Raten wurden mit einem BioTek Synergy MT Fluoreszenz-Mikroplattenlesegerät (Ex: 360/40, Em: 460/40) bestimmt, indem die Freisetzung der fluoreszierenden AMC-Gruppe durch Hydrolyse der Amidbindung gemessen wurde. Für alle kinetischen Experimente wurden hochreine (≥98 %) Protease- und Inhibitorproteine verwendet.

Isotopenmarkierte Proben wurden in Konzentrationen von 0,2–0,3 mM in 100 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) mit 5 % D2O hergestellt. NMR-Spektren wurden mit der Software Topspin3.6.1 auf Bruker AVANCE III 600- und 900-MHz-Spektrometern gesammelt, die mit Z-Gradienten-1H/13C/15N-Dreifachresonanz-Kryosonden ausgestattet waren. Standardmäßige Doppel- und Dreifachresonanzexperimente (HNCACB, CBCA(CO)NH, HNCO, HN(CA)CO und HNHA) wurden verwendet, um die NMR-Zuordnungen der Hauptkette zu bestimmen. Die Abstände zwischen den Protonen wurden aus 3D-15N-bearbeiteten NOESY- und 3D-13C-bearbeiteten NOESY-Spektren mit einer Mischzeit von 150 ms ermittelt. Für die Datenverarbeitung wurde NmrPipe67 verwendet und die Analyse erfolgte mit Sparky68. Zweidimensionale heteronukleare {1H}-15N-NOE-Experimente im Steady-State wurden mit einer Relaxationsverzögerung von 5 s zwischen den Experimenten durchgeführt. Fehler in heteronuklearen NOEs wurden basierend auf dem Hintergrundrauschpegel geschätzt. Störungen der chemischen Verschiebung wurden unter Verwendung von Δδtotal = ((WHΔδH)2 + (WNΔδN)2)1/2 berechnet, wobei WH 1 ist, WN 0,2 ist und ΔδH und ΔδN chemische Verschiebungsänderungen bei 1H bzw. 15N darstellen. Für PRE-Experimente mit Sb1 wurden Single-Site-Cysteinmutantenproben mit 10 Äquivalenten (1-Oxyl-2,2,5,5-Tetramethylpyrrolin-3-methyl)methanthiosulfonat (MTSL), Santa Cruz Biotechnology) bei 25 °C inkubiert für 1 Stunde und der Abschluss der Markierung wurde durch MALDI-Massenspektrometrie bestätigt. Kontrollproben wurden mit 10 Äquivalenten Natriumascorbat reduziert. Die Peakintensitäten des Rückgratamids im oxidierten und reduzierten Zustand wurden mit Sparky analysiert. Dreidimensionale Strukturen wurden mit CS-Rosetta3.2 unter Verwendung experimenteller Rückgrat-15N-, 1HN-, 1Hα-, 13Cα-, 13Cβ- und 13CO-chemischer Verschiebungsbeschränkungen berechnet und entweder durch Vergleich mit experimentellen Rückgrat-NOE-Mustern (A1, B1, B4, Sb1) validiert oder direkt eingesetzte Interprotonen-NOEs (Sa1, Sb2) oder PREs (Sb1) als zusätzliche Restriktionen. Es wurden eintausend CS-Rosetta-Strukturen berechnet, aus denen die zehn Strukturen mit der niedrigsten Energie ausgewählt wurden. Für Sb3 gelang es CS-Rosetta nicht, zu einer einzigartigen Niedrigenergietopologie zu konvergieren, was trotz der chemischen Verschiebungen und des NOE-Musters, die auf eine S-Faltung hinweisen, eine annähernd gleichmäßige Mischung aus S- und B-Typ-Faltungen erzeugte. In diesem Fall wurde CNS1.169 verwendet, um die Struktur56 zu bestimmen, einschließlich der Rückgrat-Diederbeschränkungen aus Daten zur chemischen Verschiebung unter Verwendung von TALOS-N70. Die Rückgratresonanzen für den S-Zustand von Sb4 wurden mithilfe von Dreifachresonanzmethoden wie oben unter Bedingungen zugeordnet, bei denen der S-Zustand günstiger besetzt ist (30 °C, 100 mM KPi, 200 mM Natriumchlorid, pH 7,0). Amidzuordnungen wurden dann auf das zweidimensionale 1H-15N-HSQC-Spektrum von Sb4 bei 25 °C in 100 mM KPi, pH 7,0, übertragen. Interprotonen-NOEs für den S-Zustand von Sb4 wurden bei 30 °C/hohem Salzgehalt unter Verwendung eines 3D-15N-bearbeiteten NOESY-Spektrums mit einer Mischzeit von 150 ms erhalten. Ein zweidimensionales ZZ-Austausch-1H-15N-HSQC-Spektrum wurde auf Sb4 mit einer Mischzeit von 300 ms (25 °C, 100 mM KPi, pH 7,0)71,72 aufgezeichnet. Proteinstrukturen wurden mithilfe von PROCHECK-NMR73, MOLMOL74 und PyMol (Schrödinger)55 angezeigt und analysiert.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die in dieser Studie generierten NMR-Strukturen wurden im PDB hinterlegt: [https://doi.org/10.2210/pdb7MN1/pdb]; [https://doi.org/10.2210/pdb7MQ4/pdb]; [https://doi.org/10.2210/pdb7MN2/pdb]; [https://doi.org/10.2210/pdb7MP7/pdb]; [https://pdb-dev.wwpdb.org/entry.html?PDBDEV_00000083]; [https://pdb-dev.wwpdb.org/entry.html?PDBDEV_00000084]; [https://pdb-dev.wwpdb.org/entry.html?PDBDEV_00000085]. NMR-Aufgaben wurden im BMRB hinterlegt: [https://doi.org/10.13018/BMR30901]; [https://doi.org/10.13018/BMR30902]; [https://doi.org/10.13018/BMR30904]; [https://doi.org/10.13018/BMR30905]; [https://doi.org/10.13018/BMR50907]; [https://doi.org/10.13018/BMR50909]; [https://doi.org/10.13018/BMR50910]; [https://doi.org/10.13018/BMR51719]. Die in diesem Dokument genannten Strukturen sind im PDB öffentlich verfügbar: [https://doi.org/10.2210/pdb1FKA/pdb]; [https://doi.org/10.2210/pdb2VDB/pdb]; [https://doi.org/10.2210/pdb1FCC/pdb]; [https://doi.org/10.2210/pdb6UAO/pdb]; [https://doi.org/10.2210/pdb2LHC/pdb]; [https://doi.org/10.2210/pdb1RIS/pdb]. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt. Designmodelle werden als Dateien in den Quelldaten bereitgestellt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Diese Arbeit wurde durch die National Institutes of Health Grant GM62154 (an PB und JO) und 5R44GM126676 (an PB) unterstützt. Die NMR-Einrichtung wird von der University of Maryland, dem National Institute of Standards and Technology und einem Zuschuss der WM Keck Foundation unterstützt. Wir danken auch Dr. Nese Sari und Louisa Wu für die kritische Lektüre des Manuskripts und für viele nachdenkliche Kommentare. Die Erwähnung kommerzieller Produkte bedeutet keine Empfehlung oder Billigung durch NIST.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Biao Ruan, Yanan He, Yingwei Chen.

Potomac Affinity Proteins, 11305 Dunleith Pl, North Potomac, MD, 20878, USA

Biao Ruan, Yingwei Chen, Eun Jung Choi, Dana Motabar, Richard Simmerman und Philip N. Bryan

Institut für biowissenschaftliche und biotechnologische Forschung, University of Maryland, 9600 Gudelsky Drive, Rockville, MD, 20850, USA

[PubMed] [Querverweis] Yanan He, Yihong Chen, Tsega Solomon, Thomas Kauffman, D. Travis Gallagher, John Orban und Philip N. Bryan

Abteilung für Bioingenieurwesen, University of Maryland, College Park, MD, 20742, USA

Dana Motabar

Abteilung für Chemie und Biochemie, University of Maryland, College Park, MD, 20742, USA

Laugh Solomon, Thomas Kauffman und John Orban

National Institute of Standards and Technology und University of Maryland, 9600 Gudelsky Drive, Rockville, MD, 20850, USA

D. Travis Gallagher

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Proteindesign: Yw.C., BR, EC, JO, PB; Durchgeführte thermodynamische und Bindungsanalysen: BR, Yw.C., DM, RS, PB; Durchgeführte dynamische Lichtstreuexperimente: TG; Durchgeführte NMR-Experimente/Strukturanalysen: YH, Yh.C., TS, TK, JO; Verfasser der Arbeit: JO (NMR und Strukturanalyse), Yw.C., BR, PB (übrige Abschnitte).

Korrespondenz mit John Orban oder Philip N. Bryan.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Ruan, B., He, Y., Chen, Y. et al. Design und Charakterisierung eines Proteinfaltungsnetzwerks. Nat Commun 14, 431 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36065-3

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Eingegangen: 14. Juli 2022

Angenommen: 13. Januar 2023

Veröffentlicht: 26. Januar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36065-3

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Naturkommunikation (2023)

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