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Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 9297 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Als Strategie zur Bekämpfung von Krankheitserregern wurde die Hemmung des eukaryotischen Initiationsfaktors 4A vorgeschlagen. Rocaglate weisen die höchsten Spezifitäten unter den eIF4A-Inhibitoren auf, ihr antipathogenes Potenzial wurde jedoch nicht umfassend für alle Eukaryoten untersucht. In-silico-Analyse der Substitutionsmuster von sechs eIF4A1-AA-Resten, die für die Rocaglat-Bindung entscheidend sind, deckte 35 Varianten auf. Das molekulare Andocken von eIF4A:RNA:Rocaglat-Komplexen und In-vitro-Tests zur thermischen Verschiebung mit ausgewählten rekombinant exprimierten eIF4A-Varianten ergaben, dass die Empfindlichkeit mit niedrigen abgeleiteten Bindungsenergien und hohen Schmelztemperaturverschiebungen korreliert. In-vitro-Tests mit Silvestrol validierten die vorhergesagte Resistenz bei Caenorhabditis elegans und Leishmania amazonensis und die vorhergesagte Empfindlichkeit bei Aedes sp., Schistosoma mansoni, Trypanosoma brucei, Plasmodium falciparum und Toxoplasma gondii. Unsere Analyse ergab außerdem die Möglichkeit, mit Rocaglaten wichtige Krankheitserreger bei Insekten, Pflanzen, Tieren und Menschen anzugreifen. Schließlich könnten unsere Ergebnisse dazu beitragen, neuartige synthetische Rocaglat-Derivate oder alternative eIF4A-Inhibitoren zur Bekämpfung von Krankheitserregern zu entwickeln.

Die gezielte eukaryotische Translation hat sich als potenzielle Strategie zur Bekämpfung von Krankheitserregern herausgestellt1,2,3,4. Von den drei Schritten, die die Übersetzung ausmachen – Initiierung, Verlängerung und Beendigung –, hat die Initiierung aufgrund der vielen beteiligten Faktoren und ihrer geschwindigkeitsbegrenzenden Wirkung auf die Übersetzung insgesamt besonderes Interesse als Ziel geweckt5,6,7.

Der hochkonservierte eukaryotische Translationsinitiationsfaktor 4A (eIF4A), eine ATP-abhängige DEAD-Box-RNA-Helikase, spielt eine wesentliche Rolle bei der Initiierung der Translation8,9. Es gibt zwei Isoformen von eIF4A, eIF4A1 und eIF4A2, mit äquivalenten biochemischen Funktionen und einer Sequenzidentität von 90–95 %10,11. Die Expression beider Isoformen unterscheidet sich erheblich, wobei eIF4A1 in fast allen Geweben während des aktiven Zellwachstums vorhanden ist und eIF4A2 hauptsächlich in Organen mit geringen Proliferationsraten12.

Rocaglate, eine Klasse pflanzlicher Flavagline mit einer Cyclopenta[b]benzofuran-Struktur, gehören zu den wirksamsten und spezifischsten bekannten eIF4A-Inhibitoren13,14 (Abb. S1). Über 200 natürliche und synthetische Rocaglate wurden beschrieben, seit Rocaglamid A (RocA) erstmals aus asiatischem Mahagoni (Aglaia sp.) isoliert wurde, der einzigen bekannten Gattung, die Rocaglate produziert15,16,17,18. Rocaglates klemmen eIF4A:RNA-Komplexe, die RNA-Stränge mit stabilen Sekundärstrukturen wie Stammschleifen oder G-Quadruplexen und auch Polypurinabschnitte in der 5'UTR enthalten, die alle mit Unterklassen von mRNAs verbunden sind, einschließlich Protoonkogenen und viralen mRNAs19,20,21. Solche mRNAs werden bevorzugt von eIF4A verarbeitet und sind häufig mit proliferierenden Zellen und der Translationsregulation verbunden22,23,24. Die Vorliebe von eIF4A, mRNAs mit stabilen Sekundärstrukturen in ihren 5'UTRs abzuwickeln, und die Gier von Rocaglaten für die resultierenden eIF4A:RNA-Komplexe machen dies aufgrund der geringen Toxizität für Mensch und Tier zu einem potenziell praktikablen Ansatz zur Bekämpfung von Krankheitserregern25.

In-vivo-Studien haben das therapeutische Potenzial von Rocaglaten bei Krebs gezeigt. Das synthetische Analogon Zotatifin durchläuft derzeit eine klinische Phase-1/2-Studie für solide Tumoren26 und eine dosissteigernde klinische Phase-1-Studie für COVID-19, was auf sein Potenzial für eine wirtsspezifische antivirale Aktivität hinweist27. Mehrere andere Studien haben die Wirksamkeit von Rocaglaten bei der Verhinderung der Replikation mehrerer RNA-Viren gezeigt, was das Potenzial von Rocaglaten als panvirale Mittel untermauert28,29,30,31,32,33.

Das eIF4A-abhängige antipathogene Potenzial von Rocaglaten wurde für Plasmodium falciparum und P. berghei, Candida auris und mehrere andere eukaryontische Krankheitserreger nachgewiesen3,34 (siehe Tabelle S1). Andere Krankheitserreger sind gegen Rocaglate resistent, z. B. Entamoeba histolytica und Leishmania donovani35,36 (siehe Tabelle S1).

Rocaglate binden an eIF4A:RNA-Komplexe, was zu einem stabilen ternären Komplex führt, der die enzymatische mRNA-Abwicklung verhindert37,38. Ausgewählte Aminosäuren innerhalb der Rocaglat/RNA-Bindungstasche – menschliche eIF4A1-Positionen 158, 159, 163, 192, 195, 199 – sind entscheidend für den Rocaglat-Klemmmechanismus38,39,40. Die Kristallstruktur von menschlichem eIF4A1 im Komplex mit RocA, Polypurin-RNA und einem nicht hydrolysierbaren ATP-Analogon zeigt, dass Rocaglate mRNAs durch π-π-Stapelwechselwirkungen zwischen den A- und B-Phenylringen der Rocaglate und zwei Purinen reversibel an eIF4A klemmen der RNA und zwischen dem C-Phenylring des Rocaglates und dem Aminosäurerest an Position 16338. Die eIF4A-Sequenzen von Rocaglat-produzierenden Aglaia spp. weisen resistente Substitutionen auf, die die Komplexbildung sowohl an AA 163 (Phe zu Leu) als auch an AA 199 (Ile zu Met) verhindern, und ein Pilzparasit von Aglaia, Ophiocordyceps sp. BRM1 weist einen weiteren Widerstand auf, der eine Substitution bei aa 163 (Phe zu Gly)38,41 verleiht.

Hier präsentieren wir eine In-silico-Analyse von eIF4A-Sequenzen zusammen mit einer biochemischen Analyse repräsentativer Sequenzen und In-vitro-Studien mit eukaryotischen Mikroorganismen, die bisher ungetestete Varianten von eIF4A enthalten, und liefern so ein erstes umfassendes Bild des antipathogenen Potenzials von Rocaglaten. Die Ergebnisse offenbaren mögliche Evolutionsszenarien für Rocaglat-Resistenz und liefern Einblicke in Struktur-Aktivitäts-Beziehungen, die das Design von Rocaglaten oder anderen eIF4A-Inhibitoren der nächsten Generation beeinflussen könnten.

Eine globale GenBank-Suche (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) nach eIF4A-Sequenzen ergab 365 einzigartige eIF4A1- und eIF4A2-Proteinsequenzen – 78 Protisten-, 80 Pilz-, 49 Pflanzen- und 158 Tiersequenzen (Tabelle S2). . Davon entsprachen 162 Krankheitserregern protistischen (55), pilzlichen (53) oder tierischen (54) Ursprungs. Um die möglichen Wechselwirkungen dieser eIF4A-Proteine mit Rocaglaten zu bestimmen, analysierten wir die Substitutionsmuster von sechs AA-Resten (menschliche Positionen 158, 159, 163, 192, 195, 199), die sich zwischen den Motiven Ib und III von eIF4A38, 39, 42, 43 befinden ,44 (Abb. S2). Die AA-Muster, von denen bekannt ist, dass sie mit der Empfindlichkeit oder Resistenz gegenüber Rocaglaten verbunden sind, sind in Tabelle S1 aufgeführt.

Unsere Analyse deckte 35 AA-Muster auf. Vier davon – T158, P159, Y163, F192, Q195, V199; TPFFQI; TPFFQV; TPYFQI – machte 63 % aller bekannten eIF4A-Sequenzen aus und war in den vier wichtigsten eukaryotischen Abstammungslinien vorhanden (Abb. S3). Über die Hälfte der AA-Muster (24/35) war nur in einer Abstammungslinie vorhanden. Das Muster TPLFQM war in allen Rocaglat-produzierenden Aglaia-Arten vorhanden, einschließlich zweier hier beschriebener neuer Arten, Aglaia stellatopilosa und Aglaia glabriflora (Abb. S2; Zugangsnummern ON844099 bzw. ON844100). Das Muster TPGFQI kam auch nur bei einer Art vor: dem Pilzparasiten von Aglaia spp., Ophiocordyceps.

Unter den 162 analysierten Krankheitserregern identifizierten wir 24 AA-Muster. Die Protisten enthielten die höchste Diversität (14), gefolgt von Pilzen (13) und Tieren (9) (Tabelle S2). Fünf Muster – TPYFQV, TPFFQI, TPLFQI, TPHFQV, TPFFQV – machten 53 % aller pathogenen eIF4A-Sequenzen aus (Abb. 1). Zwei Drittel der AA-Muster (16/24) waren nur in einer Abstammungslinie vorhanden. Wichtig ist, dass vier AA-Muster, die mit der Empfindlichkeit gegenüber Rocaglaten assoziiert sind – TPYFQV, TPFFQI, TPYFQI, TPHFQI – bei 50 % der analysierten Krankheitserreger nachgewiesen werden konnten (Abb. 1). Weitere 14 % der Sequenzen (22/162) zeigten AA-Muster – TPLFQI, TPSFQI, TPGFQI –, die zuvor mit einer Resistenz gegen Rocaglate assoziiert waren (Tabelle S1).

Darstellung von Mustern von Aminosäuren, die für die Rocaglat-Bindung in bekannten eIF4A-Proteinen in den drei Hauptgruppen eukaryotischer Krankheitserreger entscheidend sind. Eine umfassende Analyse bekannter eIF4A-Proteine, die von Krankheitserregern kodiert werden, ergab 24 Muster von AA an den Positionen 158, 159, 163, 192, 195 und 199 (menschliche eIF4A1-Nummerierung). Fünf AA-Muster waren in allen drei Eukaryotengruppen vorhanden (I), drei Muster waren in zwei Gruppen vorhanden (II) und sechzehn Muster waren nur in einer Gruppe vorhanden (III). In allen drei Gruppen konnten Muster gefunden werden, von denen bekannt ist, dass sie eine natürliche Empfindlichkeit oder Resistenz gegen Rocaglate hervorrufen.

Zu den Krankheitserregern und Vektoren, die potenziell empfindlich gegenüber Rocaglaten sind, gehören Trichuris trichiura, Glossina morsitans, Aspergillus niger und Cryptosporidium sp.; Zu den potenziell resistenten Krankheitserregern gehören Paragonimus westermani, Blumeria graminis und Leishmania sp. (Tabelle S2).

Die Substitutionstoleranzen an den sechs Rocaglat-Bindungspositionen waren deutlich unterschiedlich, wobei vier Positionen – 158, 159, 192, 195 – hoch konserviert waren und die beiden anderen Positionen – 163, 199 – unterschiedliche Variationsgrade aufwiesen (Abb. 2). Die Aminosäurepositionen 158, 192 und 195 sind an der RNA-Bindung beteiligt, und Position 159 ist zwar selbst nicht direkt an der RNA-Bindung beteiligt, wird aber von drei RNA-bindenden Resten flankiert – 158, 160 und 161 (Abb. S2)42. Position 163 zeigte ein hohes Maß an Ersetzungstoleranz, wobei 14 verschiedene AA die Position in allen untersuchten eIF4As besetzten. Die sechs in Position 163 nicht nachgewiesenen Aminosäuren – positiv geladene basische [Arg, Lys], unpolare aliphatische [Met, Pro], unpolare aromatische [Trp] und polare [Thr] – wurden mit der Destabilisierung von α-Helices in Verbindung gebracht [Pro ] oder Modulation von Proteininteraktionen mit Nukleinsäuren [Arg]45,46,47. Position 199, Teil einer α-Helix zwischen den Motiven II und III von eIF4A, zeigte eine quasi bimodale Toleranz für Ile oder Val, zwei strukturell ähnliche aliphatische Aminosäuren mit gleicher Hydrophobie. Auf Codon-Ebene erfordert der Wechsel von Ile zu Val nur den Wechsel des ersten Nukleotids von Adenin zu Guanin (AUA, AUU oder AUC zu GUA, GUU oder GUC), und der Wechsel von Ile zu Met wird nur in Aglaia beobachtet erfordert eine Änderung des dritten Nukleotids, der „Wobble-Position“, in einem der Ile-Codons zu Guanin (AUA, AUU oder AUC zu AUG)48.

Aminosäure-Substitutionsprofile an sechs Positionen, von denen bekannt ist, dass sie für die Rocaglat-Bindung entscheidend sind. Sechs AA-Reste – 158, 159, 163, 192, 195, 199 – in der eIF4A-RNA-Bindungstasche haben sich als entscheidend für die Rocaglat-Bindung erwiesen. Natürliche Substitutionstoleranzen an jedem der sechs Reste in den 365 hier analysierten eIF4A-Sequenzen zeigten vier hochkonservierte Positionen – 158, 159, 192, 195 – und zwei variable Positionen – 163 und 199. Letztere zeigt eine quasi bimodale Häufigkeitsverteilung (I oder V), während ersteres eine promiskuitivere Häufigkeitsverteilung aufweist, wobei 14 verschiedene aa in dieser Position toleriert werden. Die oben dargestellte Struktur entspricht dem aa-Muster TPFFQI; Das gezeigte Rocaglat, das mit dem eIF4A:RNA-Komplex interagiert, ist Silvestrol. Die Sequenzlogos wurden mit Seq2Logo – 2.050 generiert.

Die Konservierung der Reste T158, P159, F192 und Q195 sowie die begrenzte Toleranz für Val und Ile an Position 199 bestätigten, dass Position 163 der Schlüsselfaktor für die Empfindlichkeit gegenüber Rocaglaten ist38,39. Mehrere der Substitutionen an Position 163 – Glu, Asp, His, Phe, Tyr – können entweder π-π-Stapel- oder hydrophobe Wechselwirkungen bewirken, wodurch die Varianten empfindlich gegenüber Rocaglaten sind49.

Die Ersetzungen an Position 163 waren über die Abstammungslinien hinweg nicht einheitlich. Bei Protisten hatten 29 % der Sequenzen Tyr an Position 163, gefolgt von Ser (15 %), Phe (14 %), Gly (14 %) und Val (12 %). Bei Pilzen war die Verteilung His (36 %), Phe (24 %), Gln (12 %) und Ala (10 %). In Pflanzen hatten 73 % der eIF4A-Sequenzen Phe in Position 163 und 10 % Tyr, während der Anteil bei Tieren 51 % Tyr und 34 % Phe betrug (Tabelle S2; Abb. S3).

Um ein evolutionäres Verständnis der Entstehung von Resistenzen gegen Rocaglate zu erlangen, projizierten wir die 365 Sequenzen auf den eukaryotischen Lebensbaum (eToL) (Abb. 3)51. Von den elf vertretenen Gruppen enthielten sechs, darunter tief verwurzelte Zweige wie Discoba (z. B. Leishmania sp.) und Metamonada (z. B. Giardia sp.), gegen Rocaglates resistente Organismen.

Verteilung der eIF4A-Rocaglat-Resistenz auf dem eToL. Grüne Kästchen kennzeichnen die in unserer eIF4A-Analyse dargestellten Kladen. Rocaglat-resistente Varianten kommen sowohl in tief verwurzelten als auch in neueren Gruppen vor. Mehrere Varianten kommen nur einer Klade vor, während andere allgemeiner verbreitet sind.

Nur Pflanzen der Gattung Aglaia, die wie alle höheren Pflanzen erst viel später in der Evolution entstanden sind, produzieren Rocaglaten. Diese Asynchronität bei der Entstehung der Rocaglat-Synthese und der eIF4A-Resistenz dagegen legt nahe, dass die „Rocaglat-Resistenz“ nicht durch die Exposition gegenüber Rocaglaten verursacht werden kann, sondern ein unbeabsichtigtes Ergebnis der Diversifizierung der eIF4A-Sequenz ist. Eine Ausnahme bildet die Aglaia sp. parasitärer Pilz Ophiocordyceps sp. BRM1, das durch direkte Exposition eine Resistenz entwickelt haben könnte41. In Aglaia könnte sich eine Resistenz entwickelt haben, als sich die Fähigkeit entwickelte, Rocaglate zu synthetisieren. Das Rocaglat-resistente AA-Muster des Aglaia eIF4A, TPLFQM, enthält die häufigste „resistente“ Substitution an Position 163, Leu.

Wir haben mehrere Organismen entdeckt, deren eIF4A-Isoformen eIF4A1 und eIF4A2 unterschiedliche Rocaglat-assoziierte AA-Muster enthalten (Tabelle S3). Unter Protisten gab es keine abweichenden Muster, außer zwischen den beiden eIF4A-Isoformen von Thecamonas trahens: dem archetypischen Rocaglat-sensitiven TPFFQI und einem Muster mit drei Substitutionen, TPLFAV. Das L163 weist auf eine mögliche Resistenz gegen Rocaglate hin, es gibt jedoch keine In-vitro- oder In-vivo-Bestätigung. Unter den Pilzen wiesen fünf Arten, die zu fünf verschiedenen Gattungen gehörten, unterschiedliche Isoformen auf. Alle Isoformen wechselten zwischen His und Ala an Position 163 und in vier Fällen zwischen Ile und Val an Position 199; das fünfte Paar hatte an dieser Position ein Val. Drei Arten – Neurospora crassa, Purpureocillium lilacinum und Diplocarpon rosae – sind bekannte Krankheitserreger. Die Auswirkung der H163A-Substitution auf die Resistenz ist nicht bekannt. Unter den Pflanzen zeigten die sechs Gattungen mit unterschiedlichen AA-Mustern mehrere Substitutionsmuster. Drei Isoformenpaare wechselten zwischen einem Cys und einem Phe an Position 163 – was lediglich eine Punktmutation des zweiten Nukleotids des entsprechenden Codons von Guanin zu Uracil (UGC oder UGU zu UUC oder UUU) erforderte – begleitet von einem Wechsel von einem Val zu Ile an Position 199. Ein weiteres Isoformenpaar wechselte an Position 199 zwischen Ile und Val, behielt aber das F163 in beiden Isoformen bei, und die Mikroalge Raphidocelis subcapitata hatte Isoformen mit einem einzigartigen Substitutionsmuster: Y163N und L199C. Schließlich zeigten alle Rocaglat-produzierenden Aglaia-Arten eine einzigartige Kombination resistenter Isoformen, TPLFQM und TPLFQI.

Tiere wiesen die größte Anzahl divergenter eIF4A-Isoformen auf. Von 14 Paaren hatten 11 wahrscheinlich neutrale Substitutionen – F163Y und I199V – und fünf hatten eine F163L-Substitution, die eine der Isoformen resistent machte. Bei den Krankheitserregern Trichuris trichiura, Schistocephalus solidus, Hymenolepis microstoma und Schistosoma mansoni wurden alle divergierenden AA-Muster mit einer resistenten/sensitiven Dichotomie gefunden.

Die Überlappung zwischen Rocaglat- und RNA-interagierenden Resten wirft die Frage auf, wie bestimmte Substitutionen die RNA-Helikase-Aktivität von eIF4A beeinflussen könnten. Es wurde berichtet, dass einzelne Mutationen in den Positionen 159, 163 und 195 keinen oder nur einen geringen Einfluss auf die RNA-Helikase-Aktivität haben39. Um die Auswirkung von AA-Substitutionen an den Positionen 163 und 199 auf die Helikaseaktivität systematisch zu bestimmen, haben wir 17 mutierte eIF4A-Proteine mit Einzel- und Doppelsubstitutionen in einem menschlichen eIF4A1-Hintergrund erzeugt (Tabelle S4). Fünf Varianten enthielten nichtnatürliche Substitutionen, um mögliche evolutionäre Einschränkungen zu testen.

Der Vergleich der RNA-Helikase-Aktivitätsprofile ergab eine enge Verteilung von Vmax über die Varianten (Abb. 4A). Die fünf nicht-natürlichen Muster zeigten einen ähnlichen Vmax-Bereich wie die natürlichen Muster. Drei der natürlichen Substitutionsmuster – TPFFQV, TPYFQI und TPLFQM – zeigten die höchsten Helikaseaktivitäten. Unter den nicht-natürlichen Mustern ist ein Mutant, der von Aglaia sp. Das Muster TPLFQM und TPHFQM zeichnete sich dadurch aus, dass es einen Vmax aufwies, der dem der drei natürlichen Muster mit hohem Vmax ähnlicher war.

RNA-Helikase-Aktivitäten von mutierten eIF4A-Proteinen, die ausgewählte natürliche und nicht-natürliche Rocaglat-assoziierte AA-Muster in einem menschlichen Gesamtproteinhintergrund enthalten. (A) Helikase Vmax des menschlichen Wildtyp-eIF4A1, das das Rocaglat-Bindungsmuster TPFFQI und 17 Varianten des menschlichen eIF4A1-Proteins enthält (Tabelle S4), darunter eine, die Aglaia sp. exprimiert. aa-Muster TPLFQM. Alle analysierten natürlichen und nicht-natürlichen AA-Muster zeigten Vmax in einem engen Bereich, was darauf hindeutet, dass die Helikase-Aktivität erhalten bleibt. (B) Direkter Vmax-Vergleich von Mutantenpaaren, die sich nur im aa-Rest an Position 199 des eIF4A-Proteins unterscheiden. Die beiden analysierten Substitutionen I199V und I199M sind die einzigen natürlichen Substitutionen an dieser Position, die in unserer globalen eIF4A-Sequenzuntersuchung aufgedeckt wurden (relative RF-Fluoreszenz; Fehlerbalken geben den mittleren Standardfehler aus drei technischen Replikaten an; Fehlerbalken in (B) zur Verdeutlichung entfernt) .

Zwei natürlich vorkommende Substitutionen an Position 199 – I199V und I199M – zeigten einen modulierenden Effekt auf die Helikaseaktivität (Abb. 4B). Der Wechsel von Ile zu Val erhöhte oder verringerte Vmax abhängig von der aa an Position 163; Der Wechsel von Ile zu Met führte zu einer äquivalenten Verstärkung des entsprechenden Vmax, unabhängig von der AA an Position 163. Die Ähnlichkeit in der Effektgröße, Richtungsabhängigkeit oder beidem dieser ausgewählten Einzelpunktmutationen an Position 199 auf dem Vmax und die Die Tatsache, dass es im Bereich der natürlichen Vmax lag, die für natürliche eIF4A-Varianten bestimmt wurde, legt nahe, dass die Substitutionstoleranz durch die Effizienz der Helikase bestimmt wird.

Die Toleranz für Substitutionen an Position 163 lässt darauf schließen, dass Reste mit unterschiedlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften die Helikaseaktivität nicht wesentlich beeinflussen. Alle hier analysierten Varianten wurden innerhalb desselben menschlichen Proteinrahmens bewertet, um potenzielle strukturelle Störfaktoren zu entfernen. Letztendlich müsste jedes der Muster innerhalb seines natürlichen Gerüsts bewertet werden, um den tatsächlichen Vmax jeder eIF4A-Variante zu bestimmen.

Das Festklemmen der mRNA an eIF4A erfordert π-π-Stapelwechselwirkungen, ein Prozess, der durch sterische Einschränkungen innerhalb der mRNA-Bindungstasche gesteuert wird. eIF4A-Varianten, die ein Phe, Tyr oder His in Position 163 enthalten, erleichtern die π-π-Stapelung und sind empfindlich gegenüber Rocaglaten, während Varianten mit Leu- oder Ser-Substitutionen dies nicht tun und resistent sind (Tabelle S2)38. Um zu bestimmen, wie sich andere Substitutionen an Position 163 auf die π-π-Stapelung auswirken, haben wir die Verschiebungen der thermischen Denaturierungstemperatur verschiedener eIF4A:RNA:Rocaglat-Komplexe gemessen.

Wir haben 18 natürliche und nichtnatürliche Varianten analysiert, die auf der Grundlage der natürlichen Prävalenz bestimmter AA-Substitutionen, z. B. Phe, Tyr, Leu oder His, und/oder ihres Potenzials zur Etablierung von π-π-Stapelwechselwirkungen, z. B. Trp, ausgewählt wurden (Tabelle S4). Um die Auswirkung von Mutationen in Position 199 zu bewerten, haben wir die Varianten so entworfen, dass sie zwischen Ile, Val und Met wechseln.

Wir haben thermische Denaturierungsverschiebungen, Δ Schmelztemperatur, für eIF4A:RNA-Komplexe mit drei Rocaglaten bestimmt: Silvestrol, Zotatifin und CR-1-31-B. Bei Silvestrol korrelierten größere Δ-Schmelztemperaturen mit der Empfindlichkeit gegenüber Rocaglaten (Abb. 5). Größere thermische Denaturierungsverschiebungen bedeuten stabilere eIF4A:RNA:Rocaglat-Komplexe, die höhere Dissoziationsenergien erfordern. Die Muster mit den größten Temperaturverschiebungen waren in unserer Umfrage auch am besten vertreten (Abb. 5). Wir beobachteten äquivalente thermische Denaturierungsverschiebungsmuster für Zotatifin und CR-1-31-B (Abb. S4).

Verschiebungen der thermischen Denaturierungstemperatur verschiedener eIF4A:RNA:Silvestrol-Komplexe sind mit der Empfindlichkeit von eIF4A gegenüber Rocaglaten verbunden. Während die relativen eIF4A-Helikase-Aktivitäten von mutierten eIF4A-Proteinen, die unterschiedliche Rocaglat-bindende AA-Muster exprimieren, in einem engen Bereich der Vmax-Werte liegen und nicht mit der Rocaglat-Empfindlichkeit korrelieren, zeigte eine vergleichende thermische Verschiebungsanalyse der mutierten Proteine einen klaren Zusammenhang zwischen der Empfindlichkeit gegenüber Rocaglaten und höher thermische Denaturierungsunterschiede zwischen den eIF4A:RNA- und eIF4A:RNA:Silvestrol-Komplexen. Die erhöhte Stabilität der Rocaglat-empfindlichen Mutanten wird durch π-π-Stapelwechselwirkungen bestimmt, die durch die entsprechenden AA-Reste an Position 163 hervorgerufen werden. Die Datenpunkte stellen Mittelwerte von drei technischen Replikaten dar. Standardfehler für die Helikaseaktivitäten sind in Abb. 4A angegeben und Standardfehler für die Δ-Schmelztemperatur sind in Tabelle S5 aufgeführt. Die Größe der Kreise gibt die Prävalenz des AA-Musters unter den in unserer Umfrage einbezogenen eIF4As an.

Bei allen Messungen handelte es sich um Einzel- oder Doppel-AA-Varianten auf einem menschlichen eIF4A1-Proteingerüst. Durch diese Analyse wurden potenzielle strukturelle Störfaktoren entfernt, aber auch eine Bewertung der Substitutionen in ihrem natürlich entstandenen strukturellen Kontext verhindert. Beispielsweise betrug die Δ-Schmelztemperatur von gereinigtem Aedes aegypti eIF4A1 (TPHFQV) mit Silvestrol 8,45 °C und war damit höher als die 6,41 °C, die für die humane eIF4A1-Variante von TPHFQI beobachtet wurden (Tabelle S6). Und ein H163L-Mutant des Ae. aegypti eIF4A zeigte eine Verringerung der Δ-Schmelztemperatur um 2,35 °C auf 6,1 °C, was den Trend der Schmelztemperaturänderungen widerspiegelt, der für dieselben aa 163-Mutationen (F163H und F163L) im menschlichen eIF4A1-Proteingerüst beobachtet wurde (Tabelle S6). Diese Ergebnisse unterstreichen die Notwendigkeit, die Empfindlichkeit von eIF4A gegenüber Rocaglaten in ihrem natürlich entstandenen Kontext zu bestimmen, um die Rocaglat-Empfindlichkeit und die RNA-Helikase-Aktivität genau zu quantifizieren.

Um zu beurteilen, ob die Rocaglat-Empfindlichkeit anhand der In-silico-Inferenz der Bindungsenergien und intermolekularen Kontaktniveaus von eIF4A:RNA:Rocaglat-Komplexen vorhergesagt werden kann, führten wir eine Docking-Analyse der eIF4A:RNA:Rocaglat-Komplexe aller 35 Muster mit Silvestrol, Zotatifin, und CR-1-31-B im menschlichen eIF4A1-Hintergrund38,52. Beide Parameter waren umgekehrt korreliert und Varianten mit den niedrigsten Bindungsenergien und höchsten intermolekularen Kontakten waren in unserer Umfrage am häufigsten (Abb. S5). eIF4A-Varianten, die mit einer oder mehreren anderen Kladen geteilt wurden, konvergierten zu Varianten mit niedriger Bindungsenergie und hohem intermolekularen Kontakt (Abb. S6).

Die kombinierte Analyse von Messungen der thermischen Denaturierungsverschiebung und abgeleiteten Bindungsenergien lieferte die stärkste Trennung zwischen empfindlichen und resistenten Varianten von eIF4A, und intermolekulare Kontakte und Empfindlichkeit gegenüber Rocaglaten waren ebenfalls damit verbunden (Abb. 6).

Die kombinierte Bindungsenergie oder intermolekulare Kontaktinferenz mit der Analyse der thermischen Denaturierungsverschiebungsmessung ausgewählter eIF4A:RNA:Silvestrol-Komplexe zeigt einen starken Zusammenhang mit der Empfindlichkeit gegenüber Rocaglaten. (A) Die Empfindlichkeit gegenüber Rocaglaten (blau) war mit hohen thermischen Denaturierungsverschiebungen und niedrigen Bindungsenergien verbunden, während die Resistenz (rot) hauptsächlich mit niedrigen Schmelztemperaturen verbunden war. Dunkelgrau kennzeichnet natürliche eIF4A1-Varianten mit ungetesteter Resistenz gegen Rocaglate; Hellgrau kennzeichnet nicht-natürliche eIF4A1-Varianten. (B) Die Empfindlichkeit gegenüber Rocaglaten (blau) war mit hohen thermischen Denaturierungsverschiebungen und hohen intermolekularen Kontakten verbunden, während die Resistenz (rot) hauptsächlich mit niedrigen Schmelztemperaturen verbunden war. Dunkelgrau kennzeichnet natürliche eIF4A-Varianten mit ungetesteter Resistenz gegen Rocaglate; Hellgrau kennzeichnet nicht-natürliche eIF4A-Varianten; Die gestrichelte Linie zeigt die ungefähre Trennung zwischen Rocaglat-empfindlichen und -resistenten Varianten. Die Datenpunkte stellen Mittelwerte aus drei technischen Replikaten (Δ Schmelztemperatur) und Einzelwerte aus der optimierten Docking-Analyse (intermolekulare Kontakte) dar. Standardfehler für die Δ-Schmelztemperatur sind in Tabelle S5 aufgeführt.

Analoge Analysen mit Zotatifin und CR-1-31-B ergaben ein potenziell prädiktives Muster der Rocaglat-Empfindlichkeit, das sich in vier bekannten empfindlichen Varianten widerspiegelte – höhere Schmelztemperaturverschiebungen und Bindungsenergien für Silvestrol und praktisch überlappende Werte für Zotatifin und CR-1-31-B (Abb. 7). Eine weitere eIF4A-Variante, TPFFQV, die noch nicht in vitro untersucht wurde, zeigte ein nahezu identisches Muster wie die bekannten Rocaglat-empfindlichen Varianten (Abb. 7).

Direkter Vergleich kombinierter Bindungsenergie-Schlussfolgerungen und Messungen der thermischen Denaturierungsverschiebung für Silvestrol, Zotatifin, CR-1-31-B. Alle eIF4A1-Varianten, von denen bekannt ist, dass sie gegenüber Rocaglaten empfindlich sind (blau), zeigten bemerkenswert ähnliche Muster für alle drei Rocaglate. Im Gegensatz dazu zeigten die vier hier analysierten Rocaglat-resistenten Varianten (rot) sehr unterschiedliche Muster. Die vier Varianten, für die keine experimentelle Bestimmung der Empfindlichkeit gegenüber Rocaglaten existiert (dunkelgrau), zeigten zwei unterschiedliche Muster – eines, das dem der hier analysierten empfindlichen Muster analog war, und drei, die untereinander analog waren und sich von allen anderen empfindlichen Mustern unterschieden resistente Muster.

Strukturbasierte Computermodelle ergaben, dass Silvestrol über seine 1,4-Dioxan-Einheit auch mit benachbarten Arg-Resten auf der Oberfläche von eIF4A – Arg110, Arg282 und Arg311 – interagieren kann (Abb. S7). Diese Arg-Reste gehören zu strukturell unterschiedlichen und konservierten Motiven von eIF4A: Arg110 ist Teil der PTRELA-Sequenz von Motiv Ia, Arg282 ist Teil der VIFCNTR-Sequenz von Motiv IV und Arg311 ist Teil des QxxR-Motivs. Diese drei Motive falten sich zu einer konservierten „Arg-Tasche“ neben der RNA-Bindungstasche42. Arg311 ist auch an der Bildung einer kritischen Salzbrücke zu den Phosphatgruppen der RNA38,53 beteiligt.

Mutagenesestudien der Arg-Tasche zeigten, dass einzelne und dreifache Substitutionen dieser Reste durch Ala zu einer verringerten Fähigkeit der RNA zur Bildung eines Komplexes mit eIF4A führen, was zu unterschiedlichem Ausmaß der Klemmung mit Silvestrol, RocA und CR-1-31-B führt (Tabelle S6). Die R282A-Mutation reduzierte die Temperaturverschiebung um die Hälfte, und die R110A-Mutation führte zu keiner Temperaturverschiebung. Keine Zugabe von RNA zu den Tests führte zu einer konsistenten Destabilisierung der eIF4A-Assoziation um etwa −3,32 ℃ (SD ± 0,53) (Tabelle S6), was auf eine verringerte Fähigkeit der RNA hinweist, die R110A- und R282A-Mutanten zu binden. Das R311A und die Dreifachmutanten zeigten äquivalente negative Temperaturverschiebungen wie alle Kontrolltests ohne RNA-Zugabe, was darauf hinweist, dass die mutierten eIF4A-Proteine nicht in der Lage sind, RNA zu binden (Abb. S8).

Die Rocaglat-resistenten eIF4A-Varianten – TPLFQI, TPIFQI, TPHFQI und TPLFQM – zeigten keine klaren relativen Bindungsmuster für die drei von uns getesteten Rocaglate (Abb. 7). Die Extremwerte der experimentell und in silico ermittelten Werte für die TPLFQM-Variante, einschließlich ihrer optimalen RNA-Helikase Vmax, deuten darauf hin, dass diese Variante im Kontext von Aglaia sp. evolutionär bevorzugt ist.

Die anderen von uns analysierten natürlichen eIF4A-Varianten unbekannter Empfindlichkeit – TPVFQI, TPQFQI und TPEFQI – zeigten untereinander analoge Muster, mit niedrigeren Bindungsenergien für Silvestrol als für Zotatifin und CR-1-31-B und durchweg höheren Schmelztemperaturen für Zotatifin als für Silvestrol oder CR-1-31-B (Abb. 7). Basierend auf den aus der Docking-Analyse abgeleiteten Bindungsenergien und intermolekularen Kontakten könnte der Val-Rest an Position 163 eine durch Rocaglate ausgelöste Klemmung über hydrophobe Wechselwirkungen zwischen dem Phenylring C der Rocaglate und der aliphatischen Kette von Val vermitteln, wodurch dieses Muster für Rocaglate empfindlich wird ( Abb. 8). Das Kohlenstoffrückgrat von Val ist kürzer als das von Leu und Ile. Beide verhindern nachweislich die Bildung von π-π-Stapelungen oder hydrophoben Wechselwirkungen und ließen in unserer Docking-Analyse keine Wechselwirkung von Silvestrol mit eIF4A zu (Abb. 8). Die Docking-Analyse ergab, dass ein Val-Rest in Position 163 die Etablierung stabiler hydrophober Wechselwirkungen mit Rocaglaten begünstigen könnte.

Molekulares Andocken von Silvestrol an ausgewählte eIF4A-Varianten. (A) Aromatische oder aromatische Aminosäurereste an Position 163 wie Phe bzw. His ermöglichen die Etablierung stabiler π-π-Stapelwechselwirkungen mit Rocaglaten. (B) Substitutionen mit kurzkettigen AA-Resten wie Val ermöglichen hydrophobe Wechselwirkungen mit Rocaglaten, die das Fehlen von π-π-Stapelwechselwirkungen bis zu einem gewissen Grad ausgleichen können. (C) Lange aliphatische Seitenketten wie Leu oder Ile verhindern sterisch die Bildung stabiler hydrophober Wechselwirkungen und machen die entsprechenden eIF4As resistent gegen Rocaglat-vermittelte Klemmung des eIF4A:RNA-Komplexes.

Die Docking-Analyse der TPQFQI- und TPEFQI-Mutanten sagte die Bildung stabiler hydrophober Wechselwirkungen mit Rocaglaten in analogen Konformationen zu der π-π-Stapelung voraus, die bei Phe und Tyr oder dem aromatischen basischen aa His in Position 163 beobachtet wurde (Abb. 8). Trotz ihrer unterschiedlichen chemischen Natur zeigten Gln, ein Aminrest, und Glu, ein saurer Rest, ähnliche Bindungsenergien und thermische Denaturierungsverschiebungsmuster gegenüber Silvestrol, Zotatifin und CR-1-31-B. Diese Ähnlichkeit, die die Etablierung stabiler hydrophober Wechselwirkungen impliziert, könnte auf die langen Kohlenstoffrückgrate von Gln und Glu zurückzuführen sein.

Wir führten In-vitro-Silvestrol-Empfindlichkeitstests mit vier Arten durch, die eIF4As mit zuvor ungetesteten AA-Mustern exprimierten, vier Arten mit zuvor getesteten AA-Mustern, die jedoch zu neuen Gattungen gehörten, und einer Art, die zu einer Gattung gehörte, die zuvor als Rocaglat-empfindlich charakterisiert worden war, dies jedoch nicht der Fall war mit Silvestrol herausgefordert (Tabelle 1).

Wir haben zwei Krankheitserreger – Toxoplasma gondii und Trypanosoma brucei brucei – den Krankheitserreger Aedes aegypti und den nicht pathogenen Nematoden Caenorhabditis elegans ausgewählt, um zu testen, ob unsere Vorhersagen zur eIF4A-Empfindlichkeit bestätigt werden konnten. Ae. Aufgrund ihrer AA-Substitutionen F163H (Ae. aegypti, T. gondii) und F163V (T. brucei brucei) und C. elegans wurde vorhergesagt, dass sie empfindlich auf Silvestrol reagieren resistent gegen Silvestrol (F163G). Tatsächlich konnten wir mithilfe modellspezifischer Lebensfähigkeits-, Entwicklungs- oder Lebensdauertests alle drei Vorhersagen bestätigen (Abb. S9 und S10).

Wir ergänzten die Serie durch Tests eines weiteren wichtigen Krankheitserregers, Schistosoma mansoni, sowie der nicht pathogenen Fruchtfliegen Anastrepha suspensa und Drosophila melanogaster. Die eIF4A-Sequenzen von S. mansoni und D. melanogaster enthielten die AA-Muster TPFFQI bzw. TPYFQV, von denen zuvor gezeigt wurde, dass sie gegenüber Rocaglaten empfindlich sind. Die eIF4A-Sequenz von A. suspensa war zum Zeitpunkt des Schreibens dieses Artikels nicht verfügbar, aber die eIF4A-mRNA-Sequenz des eng verwandten A. fraterculus war verfügbar (TPYFQV)54 und angesichts der 100-prozentigen Konsens dieses Motivs über fünf Gattungen hinweg und 32 Bei den Fruchtfliegenarten (Tabelle S2) gingen wir davon aus, dass das gleiche Motiv auch bei A. suspensa vorkommt. Mit diesen Tests konnten wir die Anwendbarkeit der Sensitivitätsergebnisse einer Art auf nicht verwandte Gattungen bestätigen. Zusätzlich zu T. brucei haben wir auch zwei weitere Protozoen-Krankheitserreger getestet – Leishmania amazonensis und Plasmodium falciparum – um zu bestätigen, dass AA-Muster, die mit der Silvestrol-Empfindlichkeit bei einer Art verbunden sind, die Empfindlichkeit auf andere Arten innerhalb derselben Gattung übertragen würden, die dasselbe AA-Muster enthalten. Wir beobachteten auch, dass zwei Protozoen innerhalb derselben Familie – T. brucei und L. amazonensis zeigten Rocaglat-Empfindlichkeit bzw. -Resistenz in Übereinstimmung mit ihren entsprechenden eIF4A-AA-Mustern (Abb. S10 und S11; Tabelle 1).

Alle Tests bestätigten die Vorhersagen und erhöhten die Zahl potenzieller Krankheitserreger, die jetzt mit Rocaglaten bekämpft werden können, von den 50 %, die wir ursprünglich auf der Grundlage bekannter Sensitivitätsberichte geschätzt hatten, auf 60 % (Tabelle S2). Der Anteil potenziell resistenter Erreger stieg von 13 auf 19 % (Tabelle S2).

Die kombinierte Bindungsenergie- und thermische Denaturierungsverschiebungsanalyse zeigte analoge Muster für drei Varianten unbekannter Empfindlichkeit gegenüber Rocaglaten: TPVFQI, TPEFQI und TPQFQI (Abb. 7). Die In-vitro-Ergebnisse, die die Empfindlichkeit von TPVFQI gegenüber Silvestrol aufzeigen, legen nahe, dass Organismen, die die analoge AA-Kombination TPEFQI und TPQFQI enthalten, auch gegenüber Rocaglaten empfindlich sein könnten, was die Liste der Krankheitserreger und anderen Schadorganismen, die mit Rocaglaten bekämpft werden können, weiter erweitert (Tabelle S2).

Die sechs Aminosäurereste, die die Empfindlichkeit von eIF4A gegenüber Rocaglaten bestimmen, bieten ein Werkzeug zur Vorhersage der Empfindlichkeit. Unsere Mutantenanalyse liefert die erste In-vitro-Bestätigung für drei Vorhersagen: TPVFQI und TPHFQV (sensitiv) und TPGFQV (resistent).

TPVFQI, das in Trypanosoma sp. vorkommt, eröffnet die Möglichkeit, T. brucei (Schlafkrankheit) und T. cruzi (Chagas-Krankheit) gezielt zu bekämpfen. TPHFQV kommt in landwirtschaftlichen Krankheitserregern wie Cystoisospora suis und Marssonina coronariae sowie in den hochwirksamen Krankheitsüberträgern Aedes aegypti und Ae vor. albopictus. TPGFQV, das mit Ausnahme von Caenorhabditis elegans nur bei Protisten vorkommt, schließt die Verwendung von Rocaglaten oder seinen Derivaten für Krankheitserreger wie Phytophthora sp., Aphanomyces sp. und Saprolegnia sp. aus. Die analoge resistente Variante TPGFQI wurde bisher nur in der Art Aglaia sp. identifiziert. Pilzparasit Ophiocordyceps sp..

Die Empfindlichkeit konnte durch In-silico-Modellierung der Bindungsenergien und intermolekularen Kontaktniveaus des ternären eIF4A:RNA:Rocaglat-Komplexes sowie durch In-vitro-Analyse der Schmelztemperaturen der eIF4A:RNA-Komplexe vorhergesagt werden. Unsere Analyse zeigt das Potenzial für den Einsatz von Rocaglaten zur Bekämpfung von Krankheitserregern, es bleiben jedoch noch einige wichtige Fragen offen.

Erstens stellt die Vielfalt der eIF4A-Varianten, über die wir berichten, möglicherweise nur einen Bruchteil ihrer wahren natürlichen Vielfalt dar, liefert jedoch Einblicke in mögliche evolutionäre Einschränkungen, die die Resistenz gegen Rocaglates bestimmen und die für die Verhinderung der Entstehung weiterer Resistenzen von entscheidender Bedeutung sein könnten.

Zweitens hat unsere Analyse die Wirkung einzelner AA-Substitutionen auf die intermolekulare Dynamik in einem festen menschlichen Hintergrund gezeigt, aber wie sich diese Varianten in ihren natürlichen Proteingerüsten verhalten, muss letztendlich in ihren nativen Gerüsten bestimmt werden.

Und drittens variiert die Interaktion verschiedener Rocaglate mit eIF4A auf subtile Weise, die noch nicht vollständig verstanden ist. Beispielsweise löst die TPIFQI-Variante analoge Wechselwirkungen mit Silvestrol und CR-1-31-B aus, die sich von denen mit Zotatifin unterscheiden und daher nicht allein durch das Vorhandensein der 1,4-Dioxan-Einheit von Silvestrol erklärt werden können. Das Verständnis dieser natürlichen Wechselwirkungen wird die Entwicklung von Rocaglaten mit verbesserter Wirksamkeit und Spezifität weiter beeinflussen.

Die Zuordnung der eIF4A-Varianten zum eukaryotischen Lebensbaum – ein weithin akzeptierter Indikator für eine evolutionäre Zeitleiste – ergab eine zufällige Verteilung der Resistenzvarianten. Angesichts der Tatsache, dass die bekannte Biosynthese von Rocaglaten auf eine Pflanzengattung, Aglaia, beschränkt ist, die zu einem viel späteren Zeitpunkt als die meisten der von uns identifizierten resistenten Organismen entstanden wäre, und dass eine funktionelle Rolle von Rocaglaten in Aglaia sp. Ist nicht bekannt, können zwei Szenarien für die Entstehung einer Rocaglat-Resistenz untersucht werden.

Erstens könnte es nach der Exposition gegenüber von Aglaia biosynthetisiertem Rocaglat zu Resistenzen kommen. Die aktuelle Beschreibung der Aglaia sp. parasitärer Pilz Ophiocordyceps sp. BRM1 unterstützt ein solches Szenario. Viele andere Rocaglat-resistente Organismen weisen jedoch keine überlappende Verbreitung mit der von Aglaia oder eine globale Verbreitung auf, sodass es unwahrscheinlich ist, dass Rocaglate einen evolutionären Druck ausübten.

Alternativ könnte die Rocaglat-Resistenz ein neutrales Nebenprodukt der natürlichen eIF4A-Variation sein. Dies würde durch die Tatsache gestützt, dass die relative Vmax der verschiedenen natürlichen eIF4A-Varianten, die wir analysiert haben, bemerkenswert konstant war und dass Aglaia sp. und Ophiocordyceps sp. BRM1 sind die einzigen Organismen, bei denen beide eIF4A-Isoformen gegen Rocaglate resistent sind, was sie vor Selbstvergiftung bzw. Vergiftung durch den Wirt schützt.

Keines dieser Szenarien kann ausgeschlossen werden, da eine Substitutionstoleranz das zufällige Auftreten „resistenter“ Varianten vorantreiben könnte und physische Nähe und die Exposition gegenüber Rocaglaten gleichzeitig die Beibehaltung „resistenter“ Varianten auslösen könnten.

Wir haben potenzielle Ziele für Rocaglate auf der Grundlage der eIF4A-Sequenzen von Krankheitserregern identifiziert, die für die Gesundheit von Mensch, Tier und Pflanze von Interesse sind. Die Daten verdeutlichen auch das Potenzial für die De-novo-Entwicklung einer Rocaglat-Resistenz und die Notwendigkeit, alle antipathogenen Anwendungen von Rocaglaten sorgfältig zu steuern.

Der Einsatz antimikrobieller Mittel hat uns gelehrt, dass sich die Natur durch natürliche Evolution und das Überleben des Stärksten immer an neue Herausforderungen anpassen wird55. Dies hat zur Entstehung von Resistenzen gegen antimikrobielle Mittel geführt, sei es durch den lateralen Transfer von Genen anderer Mikroorganismen, durch De-novo-Mutationen oder durch die Umnutzung bestehender Mechanismen zur Entgiftung.

Das Auftreten einer Resistenz gegen Pestizide bei komplexeren Organismen wie Pilzen und Insekten hängt mit Faktoren wie der Anzahl der für die Resistenz erforderlichen Punktmutationen, dem Vorliegen von Resistenzallelen in einer Population und der Fitness der mutierten resistenten Varianten zusammen Das Fehlen des entsprechenden Selektionsdrucks56,57.eIF4A-Resistenz gegen Rocaglate könnte ein zufälliges Merkmal sein, das sich aus der AA-Substitutionstoleranz an Position 163 ergibt. Einzelne Punktmutationen, die zu AA-Änderungen an dieser Position führen, können einen Rocaglat-empfindlichen Organismus in einen resistenten verwandeln . Die durch Rocaglat verursachte Klemmung wird hauptsächlich durch den aa-Rest an Position 163 bestimmt. Dies geschieht jedoch unter den Einschränkungen, dass vier andere Reste unverändert bleiben müssen – 158, 159, 192 und 195 – und einer eine minimale Substitution toleriert – 199. Das Klemmen erfordert außerdem das Vorhandensein von zwei benachbarten Purin-RNA-Basen, um den eIF4A1:RNA-Komplex zu stabilisieren, was die Toleranz für Substitutionen an den relevanten RNA-interagierenden aa-Resten von eIF4A40 einschränkt. Die Kombination dieser Faktoren macht die Entstehung von Resistenzen zu einem komplexeren, wenn auch insgesamt immer noch geringen evolutionären Ereignis.

A priori scheint die natürliche Vielfalt Rocaglat-resistenter eIF4A-Allele ein großes Hindernis für die Umsetzung Rocaglat-basierter Anti-Pathogen-Strategien darzustellen. Dieser umfangreiche Katalog an Informationen über Sequenz-, Struktur- und physikalisch-chemische Faktoren, die „resistente“ Allele charakterisieren, könnte jedoch als Grundlage für die Entwicklung neuer Verbindungen, den Einsatz sorgfältig verwalteter Kontrollprogramme und die Überwachung der Entstehung potenzieller De-novo-Resistenzen dienen in verwalteten Populationen.

„Fitness Rescue“ bei Arten, die eine resistente und eine empfindliche Isoform enthalten, wurde bisher nur in Fällen gezeigt, in denen eIF4A1 die resistente Isoform ist, nicht jedoch, wenn es eIF4A2 ist, das das resistente Allel enthält. Dies ist bei den meisten der bisher von uns analysierten Krankheitserregern der Fall. Und obwohl wir keine Möglichkeit haben zu wissen, wie schnell resistente Mutationen über evolutionäre Zeitskalen hinweg erworben wurden, hat unsere Analyse gezeigt, dass resistente Mutationen zumindest theoretisch schnell durch Punktmutationsereignisse an der Codon-Wobble-Position entstehen könnten, wie am Beispiel des Wechsels von Phe zu Leu.

Alle natürlichen Varianten von eIF4A weisen relative Vmax in einem engen Bereich auf, der höchstwahrscheinlich für die Fitness des Organismus wesentlich ist. Dies gilt sowohl für resistente als auch für empfindliche Varianten von eIF4A, was darauf hindeutet, dass die Fitness kein entscheidender Faktor für die dauerhafte Etablierung eines resistenten Allels wäre.

Angesichts der minimalen Anzahl von AA-Substitutionen, die für eine Resistenz erforderlich sind, der Vorexistenz von Resistenzallelen in der Bevölkerung und des neutralen Fitnessvorteils resistenter Varianten in Abwesenheit von Rocaglaten ist die Möglichkeit für den Einsatz von Rocaglaten als Antipathogene komplex. Während die aufgeführten Faktoren das Potenzial der Nutzung von Rocaglaten zur Bekämpfung von Krankheitserregern zu gefährden scheinen, könnte dieses Wissen, das vor der Implementierung anderer antipathogener Verbindungen oft fehlte, die Grundlage für robustere und fundiertere Strategien bilden. Maßnahmen wie der punktuelle Einsatz von Rocaglaten in hoher Konzentration und umfassende Überwachungsprogramme könnten ein Ansatz sein, die Entstehung von Resistenzen zu minimieren. Die Nutzung der günstigen therapeutischen Fenster von Rocaglaten bei Menschen und Tieren im Vergleich zur Empfindlichkeit bei Pilzen und Protisten könnte entscheidend für die Entwicklung sicherer Interventionen gegen ausgewählte Rocaglat-empfindliche Parasiten sein. Die Nutzung des umfassenden Katalogs natürlicher eIF4A-Varianten, die in unserer Studie entdeckt wurden, könnte dazu beitragen, die Suche nach neuartigen synthetischen Rocaglaten oder anderen niedermolekularen Inhibitoren mit erhöhter Spezifität und Wirksamkeit weiter voranzutreiben.

Die Sequenzanalyse wurde unter Verwendung der vollständigen von Genbank abgerufenen eIF4A-Proteinsequenzen und deren Kreuzvalidierung auf UniProt durchgeführt, um spezifische Isoformen zu bestimmen. Für die Analyse wurden nur Sequenzen verwendet, die den Isoformen eIF4A1 und eIF4A2 entsprechen. Als nächstes extrahierten wir die sechs Aminosäuremotive, die mit der Rocaglat-Bindung für jede der Proteinsequenzen verbunden sind (menschliche Positionen 158, 159, 163, 192, 195, 199)38,39. Innerhalb jeder eukaryotischen Gruppierung wurden Variantenmotivverteilungen bestimmt und auf die neueste Version des eukaryotischen Lebensbaums abgebildet51. Sequenzlogos, die Aminosäuretoleranzen für die sechs analysierten Aminosäuren veranschaulichen, wurden mit Seq2Logo-2.050 gerendert.

Ausgewählte eIF4A-Varianten mit Einzel- und Doppelsubstitutionen an den Positionen 163 und/oder 199 wurden mithilfe der PCR-basierten ortsgerichteten Mutagenese eines Plasmids erzeugt, das für menschliches eIF4A1 kodiert (pET-28a( +)_eIF4A1(19-406), das ein N-terminales His enthält -Tag und eine Thrombin-Spaltungsstelle; variantenspezifische Primer aufgeführt in Tabelle S4). Doppelmutanten wurden erzeugt, indem zunächst die Mutationen an Position 163 und anschließend die Mutationen an Position 199 erzeugt wurden. Ligationsprodukte wurden in E. coli DH5α-Zellen transformiert und die Plasmide wurden sequenziert, um die entsprechenden Substitutionen zu bestätigen. Nach der Sequenzbestätigung wurden kompetente E. coli BL21 (DE3)-Zellen mit den Plasmiden transformiert und in Lysogenie-Brühe-Medium bei 37 °C bis zu einer OD600 ~ 0,5 gezüchtet. Nach Zugabe von 0,5 mM IPTG wurden die Zellen 16 Stunden lang bei 15 °C gezüchtet. Die gesammelten Zellen wurden durch Ultraschallbehandlung in einem 20 mM HEPES-KOH-Puffer (pH 7,5, 300 mM KCl, 20 mM Imidazol, 5 mM β-Mercaptoethanol, 0,1 mM EDTA, 10 % (v/v) Glycerin) mit 1× cOmplete lysiert ™, Mini, EDTA-freier Protease-Inhibitor-Cocktail (Roche). Das Lysat wurde auf einer HisTrap™ HP 1 ml-Säule (GE Healthcare) unter Verwendung eines linearen Gradienten von Beschallungspuffer zu Elutionspuffer (Beschallungspuffer mit 250 mM Imidazol) fraktioniert. Die Spitzenfraktionen wurden gesammelt, gegen einen 20 mM HEPES-KOH-Puffer (pH 7,5, 300 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT und 10 % (v/v) Glycerin) gepuffert und schockgefroren in flüssigem Stickstoff und bei –80 °C gelagert.

Die Helikaseaktivitäten der eIF4A-Varianten wurden mithilfe eines fluoreszenzbasierten Assays bestimmt. Die Fähigkeit, dsRNA-Substrate abzuwickeln, wurde unter Verwendung von zwei markierten RNA-Substraten gemessen: einem 10mer, modifiziert mit Cyanin 3 (10mer-Cy3; 5′-[CY3]GCUUUCCGGU-3′), und einem 16mer, modifiziert mit Black Hole Quencher 2 (16mer-BHQ2). ; 5′-ACUAGCACCGGAAAGC[BHQ2]-3′). Ein unmarkierter Kompetitor (10mer-Kompetitor; 5′-GCUUUCCGGU-3′) wurde verwendet, um freigesetzte Quencher-RNA einzufangen. Zur Bestimmung des maximalen Fluoreszenzsignals der Reaktion wurde ein einzelsträngiges Cy3-RNA-Substrat (ssRNA) verwendet. Äquimolare Mengen von 10mer-Cy3 und 16mer-BHQ2 wurden 5 Minuten lang bei 80 °C getempert und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert, gefolgt von einer 10-minütigen Inkubation auf Eis in 25 mM HEPES (pH 7,4 (KOH) in ddH2O). Konkurrenz-RNA wurde in einem Überschuss von 1:10 (Vol./Vol.) zu den markierten RNA-Substraten hinzugefügt und die Reaktion wurde erneut 10 Minuten lang auf Eis inkubiert, bevor sie dem Helikase-Reaktionsgemisch hinzugefügt wurde. eIF4A (Endkonzentration 25 µM) wurde der Reaktion zugesetzt und die Fluoreszenz wurde mit einem Safire 2-Mikroplattenlesegerät (Tecan) gemessen.

Thermoverschiebungstests wurden durchgeführt, indem 5 μM rekombinantes menschliches eIF4AI (19-406) mit 50 μM Polypurin-RNA (AG)5 (Biomers, Ulm, Deutschland), 1 mM AMP-PNP (Roche, Basel, Schweiz) inkubiert wurden. 100 μM Rocaglat (Silvestrol, RocA, Zotatifin oder CR-1-31-B) und 75 μM SYPRO Orange (S6650, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) in einem 20 mM HEPES-KOH-Puffer (pH 7,5, 100 mM). KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA und 10 % (v/v) Glycerin) für 10 Minuten bei RT. Die Schmelzkurven wurden zwischen 10 und 95 °C bei einer Anstiegsrate von 1,6 °C/min unter Verwendung des QuantStudio3™ Real-Time PCR-Systems (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA) in einer MicroAmp™ Fast Optical 96-Well-Platte (Applied Biosystems) gemessen , Waltham, MA, USA).

Das molekulare Docking wurde mit AutoDock, v4.258, durchgeführt. Die Proteine wurden verarbeitet, indem alle Wasserstoffatome hinzugefügt und unpolare Wasserstoffatome mit AutoDock Tools 1.5.7 zusammengeführt wurden. Die Ladungszuordnung erfolgte nach der Gasteiger-Methode mit festen Torsionen für den Liganden. Wir haben einen 60 × 60 × 60, 3,75 Å großen Gitterkasten um die aktiven Stellen mit x-, y- und z-Abmessungen von 46,355, 9,919 bzw. 47,473 festgelegt. Die starre Gitterbox wurde mit AutoGrid 4 festgelegt, gefolgt von AutoDock mit dem genetischen Lamarck-Algorithmus, um die besten Andockpositionen zu erhalten59. Die Andockungen wurden doppelt durchgeführt und die durchschnittliche Bindungsenergie angegeben. Ausgewählte Posen, die optimale Bindungsaffinitäten darstellen, wurden mit UCSF Chimera (University of California) visualisiert.

Zellproliferationstests wurden mit Insektenzelllinien (Aag2 [A. aegypti]60, AsE01 [A. suspensa]61 und S2 [D. melanogaster] (ThermoFisher)) unter Verwendung des WST-1-Tests (Sigma-Aldrich) durchgeführt. Zellen (Aag2: 1,2 × 105 Zellen/100 μL, AsE01: 1 × 105 Zellen/100 μL, S2: 6 × 104 Zellen/100 μL) wurden in Gegenwart von Silvestrol (0 nM bis 1,6 μM) inkubiert. Nach einer 24-stündigen Inkubation mit Silvestrol fügten wir das vom Hersteller angegebene WST-1-Reagenz hinzu und warteten weitere drei Stunden, bevor wir die Zellmortalität durch Messung der Absorption bei 440 nm (Referenzwellenlänge: 600 nm) bestimmten. CC50-Werte wurden für jeden Satz gemessener biologischer Replikate bestimmt (GraphPad Prism V9).

Die Wirkung der Silvestrol-Behandlung auf die Replikation von Toxoplasma gondii in MARC-145-Zellen [Elabscience] wurde 48 Stunden nach der Infektion bestimmt (h pi). Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde nach 48-stündiger Behandlung mit bis zu 100 nM Silvestrol mittels XTT-Assays kontrolliert (Lösungsmittel: DMSO (1:500); positive Kontrolle: Triton X-100-Behandlung (1:200); negative Kontrolle: einfaches Medium). Nach 48 h pi wurde die Anzahl der aus infizierten Wirtszellen in den Zellüberstand freigesetzten T. gondii-Tachyzoiten bestimmt. Die Tests wurden dreifach durchgeführt.

Lebensfähigkeitstests von T. brucei brucei (nicht rekombinanter Stamm 427) wurden 48 Stunden lang unter Verwendung von HMI-9-Medium (modifiziertes DMEM (IMDM; Cell Gro); 10 % FBS; 10 %, Serum plus (SAFC); 0,05 mM Bathocuproinsulfonat) durchgeführt ; 1,5 mM L-Cystein; 1 mM Hypoxanthin; 0,2 mM β-Mercaptoethanol; 0,16 mM Thymidin; 1 mM Pyruvat). Nach einer 48-stündigen Inkubation wurden die Zellen mit Alamar-Blau markiert und die Fluoreszenz bei 530 nm und 590 nm gemessen. Alle Tests wurden dreifach durchgeführt.

Entwicklungs- und Lebensdauertests wurden mit N2-Wildtyp-C. elegans-Würmern durchgeführt, die auf NGM-Agaroseplatten aufgezogen wurden, die mit Silvestrol infundiert und mit 30 µl OP50 E. coli/LB-Medium beimpft waren. Für die Entwicklungstests ließ man zehn Würmer zwei Stunden lang Eier legen (Synchronisation), einzelne Eier wurden auf separaten Versuchsplatten isoliert und bei 20 °C inkubiert und das erste Eiablageereignis nach 59 Stunden wurde bestimmt. Die Anzahl der Nachkommen wurde durch Zählen der Gesamtzahl der Nachkommen synchronisierter, isolierter Tiere bestimmt62. Für die Lebensdauertests durften 40 Würmer 2 Stunden lang Eier legen (Synchronisation), 15 Eier pro Platte wurden auf Versuchsplatten übertragen und bei 20 °C inkubiert, und nach 3 Tagen wurden die Mütter alle zwei Tage bis dahin auf eine frische Platte übertragen Tag acht des Erwachsenenalters, um ein Überwachsen der Nachkommen zu vermeiden. Die lebenden Würmer wurden täglich gezählt, bis sie alle starben. Unnatürliche Todesfälle wurden aus der Analyse entfernt. Alle Tests wurden mindestens dreifach durchgeführt.

Erwachsene Wurmpaare wurden in M199-Medium (Sigma-Aldrich, Deutschland) kultiviert, ergänzt mit 10 % neugeborenem Kälberserum, 1 % 1 M HEPES und 1 % ABAM-Lösung (10.000 Einheiten/ml Penicillin, 10 mg/ml Streptomycin und 25 mg/ml). Amphotericin B) bei 37 °C in einer 5 % CO2-Atmosphäre. Die Aktivität von Silvestrol (100 und 200 nM) gegen die Würmer wurde sieben Tage lang in vitro bewertet. Medium und Silvestrol wurden täglich aufgefrischt und die Wurmmotilität sowie die Anzahl der gelegten Eier nach drei und sieben Tagen mit einem Umkehrmikroskop (Labovert, Deutschland) beurteilt. Die Wurmmotilität wurde gemäß den Empfehlungen von WHO-TDR63 bewertet, wobei ein Wert von „3“ eine normale Motilität anzeigt, „2“ eine reduzierte Motilität, „1“ minimale und sporadische Bewegungen und „0“ tote Würmer (keine Bewegung innerhalb von 30 Sekunden). . Würmer wurden von infizierten Hamstern gewonnen, wie an anderer Stelle beschrieben64.

Alle Tierversuche mit syrischen Hamstern (Mesocricetus auratus) wurden in Übereinstimmung mit dem Europäischen Übereinkommen zum Schutz der für Versuche und andere wissenschaftliche Zwecke verwendeten Wirbeltiere (ETS Nr. 123; überarbeiteter Anhang A) durchgeführt und vom Regierungspräsidium genehmigt. Gießen, Deutschland (V54-19 c 20/15 h 02 GI 18/10 Nr. A 14/2017) und werden in Übereinstimmung mit den ARRIVE-Richtlinien gemeldet.

Promastigoten eines L. amazonensis-Stammes, der β-Lactamase65 exprimiert, wurden in immortalisierten J774-Makrophagenzellen [ATCC] kultiviert, die in RPMI, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % PSG, gezüchtet wurden. Kurz gesagt wurden Doppeltests mit Silvestrol und Dreifachkontrollen mit plattierten Makrophagen durchgeführt, die mit L. amazonensis in der stationären Phase infiziert waren (25 Parasiten/Makrophagen) und über Nacht bei 32 °C und 5 % CO2 inkubiert wurden. Reihenverdünnungen von Silvestrol wurden zugegeben und 96 Stunden lang bei 32 °C und 5 % CO2 inkubiert. Lebensfähigkeitstests wurden unter Verwendung von CENTA™ β-Lactamase-Substrat (EMD Chemicals) und Nonidet P-40 (Igepal CA 360, Fluka) durchgeführt und die Absorption wurde bei 405 nm gemessen.

Fluoreszenzbasierte Lebensfähigkeitstests wurden 96 Stunden lang mit erythrozytischen asexuellen Kulturen (5 % Hämatokrit) des P. falciparum-Stammes 3D7 (0,25 % Ringstadium-Parasitämie; synchron) in RPMI-Medium (RPMI 1640; 25 mM HEPES; 10 μg/ml Gentamycin; 0,5 mM Hypoxanthin; pH 6,75; 25 mM Natriumbicarbonat; 0,5 % Albumax II; 1 % O2, 5 % CO2: 94 % N2)66. Die Lebensfähigkeit wurde durch Quantifizierung der Fluoreszenz nach Anfärbung von P. falciparum-Zellen mit SYBR Green I (Molecular Probes) bestimmt.

Alle in dieser Studie analysierten Sequenzdaten wurden von Genbank abgerufen. Die beiden neuen Sequenzen, die Aglaia stellatopilosa und Aglaia glabriflora entsprechen, wurden in der GenBank hinterlegt (Zugangsnummern ON844099 [Aglaia stellatopilosa Voucher SBC6708 eukaryotischer Initiationsfaktor 4a (eiF4A) mRNA, teilweise cds] und ON844100 [Aglaia glabriflora Voucher SBC0002 eukaryotischer Initiationsfaktor 4a iso Formular 1 (eIF4A) mRNA, partielle cds]). Alle anderen in dieser Studie präsentierten Daten sind in den Ergänzungstabellen vollständig aufgeführt.

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Die Autoren danken Christina Scheld, Georgette Stovall und Christin Ritter für die hervorragende technische Unterstützung.

Open-Access-Förderung ermöglicht und organisiert durch Projekt DEAL. Diese Arbeit wurde vom LOEWE-Zentrum DRUID (Projekt A2 bis AG, A4 bis AH, B4 bis CGG, D4 bis CH und AT, D5 bis MFS und IH und E1 bis SH und CGG) und dem Bundesministerium für Wissenschaft und Bildung gefördert (BMBF) über das HELIATAR-Projekt (Projekt 16GW0259 an AH und Projekt 16GW0258K an AG) und das DLR-Projekt (Projekt 01DG20023 an CH). Die Forschung von FCS und AHL wurde teilweise von den National Institutes of Health (R35GM131877 und U01GM110714 an FCS) und dem Howard Hughes Medical Institute (Faculty Scholar Grant an FCS) unterstützt.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Wiebke Obermann und Mohammad Farhan Darin Bin Azri.

Institut für Pharmazeutische Chemie, Philipps-Universität Marburg, Marburg, Deutschland

Wiebke Obermann, Leonie Konopka, Nina Schmidt, Francesca Magari, Andreas Heine & Arnold Grünweller

Sarawak Biodiversitätszentrum, Kuching, Sarawak, Malaysia

Mohammad Farhan Darin Azri, Gilbert Sei Kung Lau, Tiong Chia Yeo und Gaspar Taroncher-Oldenburg

Abteilung für Mikrobiologie, New York University Grossman School of Medicine, New York, NY, USA

Julian Sherman & Ana Rodriguez

Institut für Parasitologie, Fakultät für Veterinärmedizin, Justus-Liebig-Universität Gießen, Gießen, Deutschland

Liliana M. R. Silva, Carlos Hermosilla, Hicham Houhou, Simone Haeberlein, Christoph G. Grevelding & Anja Taubert

Boyce Thompson Institute, Abteilung für Chemie und Chemische Biologie, Cornell University, Ithaca, NY, USA

Andreas H. Ludewig & Frank C. Schroeder

Institut für Insektenbiotechnologie, Justus-Liebig-Universität Gießen, Gießen, Deutschland

Mona Yiting Luo, Irina Hacker & Marc F. Schetelig

Gaspar Taroncher Consulting, Philadelphia, PA, USA

Gaspar Taroncher-Oldenburg

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Korrespondenz mit Tiong Chia Yeo, Arnold Grünweller oder Gaspar Taroncher-Oldenburg.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Obermann, W., Azri, MFD, Konopka, L. et al. Breites antipathogenes Potenzial der auf DEAD-Box-RNA-Helikase eIF4A gerichteten Rocaglate. Sci Rep 13, 9297 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35765-6

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Eingegangen: 23. November 2022

Angenommen: 23. Mai 2023

Veröffentlicht: 08. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35765-6

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