GPCR-Aktivierung der Klasse B1 durch einen intrazellulären Agonisten

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G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) nehmen im Allgemeinen spezifische Liganden in den orthosterischen Bindungstaschen auf. Die Ligandenbindung löst eine allosterische Konformationsänderung des Rezeptors aus, die zur Aktivierung intrazellulärer Transducer, G-Proteine und β-Arrestine führt. Da diese Signale häufig nachteilige Auswirkungen haben, muss der selektive Aktivierungsmechanismus für jeden Wandler aufgeklärt werden. Daher wurden viele orthosterisch wirkende Agonisten entwickelt, und intrazellulär wirkende Agonisten haben in letzter Zeit großes Interesse auf sich gezogen. Diese Agonisten binden innerhalb der intrazellulären Höhle des Rezeptors und stimmen bevorzugt den spezifischen Signalweg gegenüber anderen Signalwegen ab, ohne dass eine allosterische Umlagerung des Rezeptors von der extrazellulären Seite her erfolgt1,2,3. Derzeit sind jedoch nur antagonistengebundene Strukturen verfügbar1,4,5,6, und es gibt keine Hinweise darauf, dass eine voreingenommene Agonistenbindung innerhalb der intrazellulären Höhle stattfindet. Dies schränkt das Verständnis des intrazellulär voreingenommenen Agonismus und der möglichen Arzneimittelentwicklung ein. Hier berichten wir über die kryogene elektronenmikroskopische Struktur eines Komplexes aus Gs und dem menschlichen Parathormon-Typ-1-Rezeptor (PTH1R), der an einen PTH1R-Agonisten, PCO371, gebunden ist. PCO371 bindet innerhalb einer intrazellulären Tasche von PTH1R und interagiert direkt mit Gs. Der PCO371-Bindungsmodus ordnet die intrazelluläre Region ohne extrazellulär induzierte allosterische Signalausbreitung in Richtung der aktiven Konformation um. PCO371 stabilisiert die deutlich nach außen gebogene Konformation der Transmembranhelix 6, was die Bindung an G-Proteine statt an β-Arrestine erleichtert. Darüber hinaus bindet PCO371 in der hochkonservierten intrazellulären Tasche und aktiviert 7 der 15 GPCRs der Klasse B1. Unsere Studie identifiziert eine neue und konservierte intrazelluläre Agonistenbindungstasche und liefert Hinweise auf einen voreingenommenen Signalmechanismus, der auf die Rezeptor-Transducer-Schnittstelle abzielt.

GPCRs stellen die größte Familie menschlicher Proteine dar und sind an nahezu allen physiologischen Prozessen beteiligt. Folglich sind sie das Ziel von mehr als 30 % der vermarkteten Arzneimittel7. Agonisten binden an eine extrazelluläre orthosterische Bindungstasche von GPCRs, was Konformationsänderungen induziert und die aktive Konformation der Transmembrandomäne (TMD) stabilisiert. Die orthosterischen Taschen haben sehr unterschiedliche Formen und Sequenzen entwickelt, die Reaktionen auf eine Reihe extrazellulärer Reize ermöglichen8. Zusätzlich zu orthosterischen Agonisten wurden zahlreiche allosterische Modulatoren erzeugt, und in früheren Strukturstudien wurden verschiedene allosterische Taschen identifiziert9. Im Vergleich zu orthosterischen Stellen weisen allosterische Stellen tendenziell eine größere Vielfalt an Aminosäureresten auf; Daher sorgen allosterische Liganden für Subtypspezifität für Rezeptoren. Obwohl frühere Strukturstudien präzise und spezifische Erkennungsmodi für orthosterische und allosterische Liganden durch einzelne Rezeptoren aufgedeckt haben, wurden konservierte Agonistenbindungstaschen über verschiedene Rezeptorsubtypen hinweg noch nicht entdeckt10.

Die meisten Agonisten aktivieren mehrere Signalwege, und einige dieser Signale lösen gelegentlich nachteilige pharmakologische Wirkungen aus. Voreingenommene Agonisten, die bevorzugt einen bestimmten intrazellulären Transducer aktivieren, haben das Potenzial, die therapeutische Wirkung zu maximieren und gleichzeitig Nebenwirkungen zu reduzieren10. Aktuelle voreingenommene Agonisten binden üblicherweise an die extrazelluläre Hälfte der TMD, während Agonisten, die an die intrazelluläre Seite, insbesondere an der Rezeptor-Transducer-Grenzfläche, binden, für eine präzise Modulation der voreingenommenen Signalwirkung möglicherweise vorzuziehen sind2. Bisher wurden sechs Strukturen intrazellulärer ligandengebundener GPCRs beschrieben1,4,5,6,11,12. Bei den meisten davon handelt es sich jedoch um antagonistengebundene Strukturen, und es gibt keine strukturellen Hinweise auf eine voreingenommene Bindung von Agonisten an eine intrazelluläre Transducertasche1,4,5,6. Dieser Mangel an Wissen schränkt die Fähigkeit ein, diesen intrazellulär voreingenommenen Agonismus zu verstehen und zu optimieren.

PTH1R ist ein GPCR der Klasse B1 und ein wichtiger Regulator der Mineralionenhomöostase und des Knochenstoffwechsels. PTH1R reagiert auf Nebenschilddrüsenhormon (PTH) und Nebenschilddrüsenhormon-verwandte Peptid (PTHrP)-Liganden und aktiviert Gs, Gq und β-Arrestine13. Natürliche und modifizierte Formen dieser Liganden induzieren eine erhebliche anabole Knochenbildung und werden zur klinischen Behandlung von Osteoporose eingesetzt14,15. Allerdings induzieren diese Liganden auch eine katabole Knochenresorption, was nachteilige Auswirkungen hat. Das Gleichgewicht zwischen therapeutischen und unerwünschten Wirkungen hängt von den Unterschieden in der Dauer der Gs-vermittelten zyklischen AMP-Produktion ab16. Die Puls-Gs-Aktivierung an der Plasmamembran induziert eine vorübergehende cAMP-Produktion. Umgekehrt wird aktiviertes PTH1R durch β-Arrestine internalisiert und induziert eine anhaltende cAMP-Produktion am frühen Endosom, was zu nachteiligen Auswirkungen führt. Daher sind G-Protein-abhängige Agonisten bei der Behandlung von Osteoporose nützlich; Allerdings sind die Mechanismen der G-Protein-gesteuerten Aktivierung bei PTH1R weitgehend unbekannt.

Wir haben zuvor über die Strukturen von PTH- und PTHrP-PTH1R-Gs-Komplexen berichtet und so strukturelle Einblicke in die Gründe für das Auftreten unerwünschter Wirkungen gegeben17. Obwohl diese Informationen für die Entwicklung peptidbasierter Arzneimittel gegen PTH1R von entscheidender Bedeutung sind, müssen Peptide durch subkutane Injektion verabreicht werden, und nicht-peptidische und oral verabreichte Agonisten sind wünschenswert, um die körperliche Belastung der Patienten zu verringern. Kürzlich wurde gezeigt, dass PCO371, ein nicht-peptidischer chemischer PTH1R-Agonist, bei oraler Verabreichung in vivo eine PTH-mimetische Aktivität aufweist18. Es liegen jedoch keine Strukturinformationen für PCO371-gebundenes PTH1R vor; Daher müssen die Bindungsstelle und der Aktivierungsmechanismus von PCO371 noch geklärt werden.

Um aufzuklären, wie PCO371 an PTH1R bindet und dessen Konformationsumlagerung induziert, haben wir die Struktur des PCO371-PTH1R-Gs-Signalkomplexes bestimmt. PTH1R wurde in HEK293-Zellen exprimiert, in einer Lösung von Laurylmaltoseneopentylglykol (LMNG) mit Cholesterylhemisuccinat (CHS) solubilisiert und in Glyco-diosgenin (GDN) mit der CHS-Lösung in Gegenwart von PCO371 gereinigt. Aufgrund der Löslichkeitsanforderungen von PCO371 in hohen Konzentrationen (Methoden) verwendeten wir während der Reinigung eine Lösung mit einem pH-Wert von 9,0. PCO371 erhöhte die Gs-Aktivität unter leicht basischen Bedingungen (pH 9,0) signifikant, wohingegen die PTH-induzierte Gs-Aktivierung sowohl bei physiologischem pH-Wert (pH 7,4) als auch bei pH 9,0 gleichwertig war (Extended Data Abb. 1). PCO371-gebundenes PTH1R wurde mit dem manipulierten Mini-Gs-Heterotrimer und dem Nanokörper 35 (Nb35) gemischt, um einen Nb35-stabilisierten PCO371-PTH1R-Mini-Gs-Komplex zu bilden. Nach der Reinigung wurde dieser Signalkomplex mit einem kryogenen Transmissionselektronenmikroskop Titan Krios G4 mit einem K3-Detektor abgebildet. Partikelbilder wurden nach 2D- und 3D-Klassifizierungen kategorisiert und dann zur Erstellung einer kryogenen Elektronenmikroskopie (Kryo-EM)-Dichtekarte mit einer globalen Auflösung von 2,9 Å verwendet (Abb. 1a, erweiterte Daten Abb. 2 und erweiterte Datentabelle 1). Diese Primärkarte ermöglichte eine eindeutige Zuordnung der Sekundärstruktur und der Seitenkettenorientierungen des PCO371-PTH1R-Gs-Komplexes mit Ausnahme der extrazellulären Domäne von PTH1R (Abb. 1b und Extended Data Abb. 3). Es wurde keine klare Dichte beobachtet, die der extrazellulären Domäne entspricht, was im Gegensatz zur zuvor bestimmten PTH-PTH1R-Gs-Komplexstruktur und mehreren Strukturen des kleinen chemischen Agonisten-gebundenen Glucagon-ähnlichen Peptid-1-Rezeptors (GLP-1R)-Gs-Komplexes steht ( Erweiterte Daten Abb. 4a,b). Dieser strukturelle Unterschied weist darauf hin, dass die extrazelluläre Domäne äußerst flexibel ist und keinen bestimmten Konformationszustand benötigt, um die Gs-Einbindung mit PTH1R zu ermöglichen.

a, Orthogonale Ansichten des PCO371-PTH1R-Gs-Komplexes, erstellt aus der Kryo-EM-Potentialkarte und entsprechend der Untereinheit gefärbt. Violett, PCO371-gebundenes PTH1R; Magenta, PCO371; gelbe, Mini-Gαs-Ras-ähnliche Domäne; Tomate, Gβ1; Marine, Gγ2; puderblau, Nb35. b, Dichtekarte und konstruiertes Modell von PCO371 in der Nähe der PCO371-Bindungstasche. c, Nahaufnahme der PCO371-Bindungsstelle. Numerische Hochstellungen geben relative Positionen im Rezeptor gemäß der Wootten-Klasse-B1-GPCR-Nummerierung der TMD-Region des Rezeptors an33. Die Karte wird in der Zählerebene 2.085 e A–3 angezeigt. d, Chemische Struktur von PCO371. PCO371 besteht aus vier chemischen Gruppen (von links nach rechts dargestellt): Trifluormethoxyphenyl, Spiroimidazolon, Dimethylphenyl und DMH.

Bemerkenswerterweise fehlte dem PTH1R-Komplex jegliche offensichtliche Ligandendichte in der orthosterischen Bindungstasche, deren Merkmale bisher für die meisten anderen Agonisten-gebundenen GPCR-Strukturen der Klasse B1 nicht berichtet wurden (Extended Data, Abb. 4b). Stattdessen beobachteten wir eine deutliche PCO371 entsprechende Dichte in einer intrazellulären Transducer-Bindungstasche, die durch die Transmembranhelix 2 (TM2), TM3, TM6 und TM7 gebildet wurde und räumlich von der extrazellulären orthosterischen Tasche getrennt war (Abb. 1a – c und erweitert). Daten Abb. 4b). Die meisten Ligand-Rezeptor-Kontakte wurden durch Van-der-Waals- und hydrophobe Wechselwirkungen vermittelt, was mit der hydrophoben Natur von PCO371 übereinstimmt (erweiterte Datentabelle 2). Bemerkenswert ist, dass Tyr4597.57 (hochgestellte Zahlen spiegeln die GPCR-Nummerierung der Wootten-Klasse B1 wider) Wasserstoffbrückenbindungen mit der Hauptkettencarbonylgruppe von Val4126.44 und PCO371 bildete, was den PCO371-PTH1R-Gs-Komplex stabilisiert (Abb. 1c). Darüber hinaus sequestrierte die Seitenkette von Tyr4597.57 PCO371 von Membranlipiden (Abb. 1a, b). Die Carbonylgruppe von Dimethylhydantoin (DMH) auf PCO371 bildete eine Salzbrücke mit Arg2192.46 (Abb. 1a, c, d). Bemerkenswerterweise interagierte die DMH-Gruppe von PCO371 (Abb. 1d) mit dem carboxyterminalen Haken von Gαs, der PCO371 dicht in den Rezeptorkern packte (Abb. 1a, d). Diese Wechselwirkungen stehen im Einklang mit den Ergebnissen unserer vorherigen Studie zur Beziehung zwischen chemischer Struktur und Aktivität, die ergab, dass das Fehlen der PCO371-DMH-Gruppe zu einer signifikanten Abnahme der Wirksamkeit führte20,21. Unsere strukturellen Beobachtungen legen zusammen mit den bisherigen Erkenntnissen zur Beziehung zwischen chemischer Struktur und Aktivität nahe, dass PCO371 ein Agonist ist, der an Gs und den intrazellulären Hohlraum des Rezeptors bindet.

Um die Gesamtstruktur des PCO371-PTH1R-Gs-Komplexes zu charakterisieren, verglichen wir diese Struktur mit denen von PTH-PTH1R-Gs und konstruiertem PTH (ePTH)-gebundenem PTH1R17,22. Die PTH-gebundene PTH1R-Struktur besaß die charakteristischen Merkmale aktiver GPCR-Strukturen der Klasse B1. Kurz gesagt, der extrazelluläre Teil dieser Struktur zeigte die Einwärtsbewegung von TM1, TM7 und der dritten extrazellulären Schleife sowie die Auswärtsbewegung von TM6, was die signifikante Auswärtsbewegung von TM6 im intrazellulären Teil induzierte. Umgekehrt zeigte die ePTH-gebundene PTH1R-Struktur, die einzige inaktiv-ähnliche PTH1R-Struktur, inaktive Konformationen im TMD-Kern und im intrazellulären Teil, obwohl der extrazelluläre Teil aufgrund der Bindung eines manipulierten Agonisten leicht in Richtung einer aktiven Konformation verschoben war (Abb. 2a,b).

a, Überlagerung der Komplexe PCO371–PTH1R–Gs und PTH–PTH1R–Gs (Klasse 2, eine repräsentative aktive Form), ausgerichtet auf TM2–TM5. Die Augen- und Pfeilsymbole geben die Blickwinkel in b und c an. b,c: Extrazelluläre (b) und intrazelluläre (c) Ansichten der überlagerten TMDs von PCO371-gebundenem aktivem PTH1R, PTH-gebundenem aktivem PTH1R und ePTH-gebundenem inaktivem PTH1R. b: Zwei-Wege-Pfeile zeigen die Abstände der Cα-Atome der Reste Thr1921.44 (TM1), Ile4226.54 (TM6) und Met4457.43 (TM7) zwischen den Strukturen von PCO371-gebundenem PTH1R und PTH-gebundenem aktivem PTH1R oder dazwischen an die Strukturen von PCO371-gebundenem und ePTH-gebundenem inaktiv-ähnlichem PTH1R. c: Der Einwegpfeil zeigt die typische Auswärtsbewegung von TM6 in PCO371-gebundenem PTH1R und PTH-gebundenem PTH1R an. d, Allosterischer kompetitiver Bindungsmechanismus von PCO371 und PTH. PTH und PCO371 stoßen an den gestrichelten Kreisen mit der anderen ligandengebundenen Konformation zusammen. e, Überlagerte Strukturen von PTH-gebundenem PTH1R, PCO371-gebundenem PTH1R, inaktiven oder inaktiv-ähnlichen Klasse-B1-GPCRs (PTH1R, GCGR, GLP-1R und CRF1R) und allen anderen Strukturen von endogenen Agonisten-gebundenen Klasse-B1-GPCRs (PTH2R, SCTR, GHRHR, PAC1R, VIP1R, VIP2R, GCGR, GIPR, GLP-1R, GLP-2R, CALCR, CALRL, CRF1R und CRF2R). Der Winkel wird zwischen den Cα-Atomen der Reste Ile/Met/Val6.54, Gly6.50 und Val/Ala/Leu6.39 in TM6 angezeigt. Beachten Sie, dass der Winkel von PCO371-gebundenem PTH1R aufgrund des Knicks bei Pro6.47 aus Leu6.39, Pro6.47 und Ile6.54 berechnet wird.

Vergleiche zwischen den Strukturen der PCO371-PTH1R-Gs-, PTH-PTH1R-Gs- und ePTH-gebundenen PTH1R-Strukturen zeigten die deutliche Konformation des PCO371-induzierten aktiven Zustands. Erstens verschoben sich die extrazellulären Anteile von TM1, TM6 und TM7 in PCO371-gebundenem PTH1R im Vergleich zur PTH-gebundenen aktiven PTH1R-Struktur um etwa 6 Å nach außen, 6 Å nach innen und 4 Å nach außen (Abb. 2a, b). Diese Teile von TM1 und TM7 bewegten sich im Vergleich zu ePTH-gebundenem PTH1R weiter nach außen, und der Teil von TM6 bewegte sich weiter nach innen. Diese Bewegungen stehen im Einklang mit der zuvor charakterisierten inaktiv-aktiven Konformationsänderung in den GPCR-Strukturen der Klasse B1 19, 22, 23, 24, 25 (Abb. 2b und erweiterte Abb. 5a), was darauf hinweist, dass die extrazellulären Teile des TMD die inaktive Konformation annehmen in der PCO371-gebundenen PTH1R-Struktur. Im Gegensatz zum extrazellulären Teil zeigte der intrazelluläre Teil der TMD in PCO371-gebundenem PTH1R die Auswärtsbewegung von TM6, die der Bewegung in der aktiven PTH-PTH1R-Gs-Struktur ähnelt (Abb. 2c). Diese ausgeprägte extrazelluläre Konformation führte dazu, dass sich TM6 in der PCO371-gebundenen PTH1R-Struktur abwickelte und mäßig geknickt wurde (ungefähr 145°), was sich von dem stark geknickten TM6 (ungefähr 90°) in der PTH-gebundenen PTH1R-Struktur unterscheidet (Extended Data Abb. 5b). Die Überlagerung der PCO371-gebundenen PTH1R- und der PTH-gebundenen PTH1R-Strukturen ergab, dass PCO371 räumlich mit der stark geknickten TM6-Konformation in PTH-gebundenem PTH1R kollidierte (Abb. 2d). Darüber hinaus kollidierte die mäßig geknickte TM6-Konformation von PCO371-gebundenem PTH1R räumlich mit dem Aminoterminus von PTH in der PTH-gebundenen PTH1R-Struktur (Abb. 2d), was mit früheren Experimenten zur Ligandenkonkurrenz 18 übereinstimmt. Die Überlagerung von GPCR-Strukturen der aktiven Klasse B1 ergab die größtenteils identischen Knickwinkel von TM6 (ungefähr 90 ° bis 100 °) in GPCR-Strukturen der aktiven Klasse B1, die an endogene oder chemische Agonisten gebunden sind (Abb. 2e, links, und erweiterte Daten, Abb. 5c, oben). und Mitte). Somit unterscheidet sich der mäßige Knick (ungefähr 145°) in TM6, der durch die PCO371-Bindung verursacht wird, von anderen aktiven Strukturen, und der Winkel liegt zwischen den Winkeln in den aktiven (92°) und inaktivähnlichen (164°) PTH1R-Strukturen (Abb . 2e, Mitte und rechts, und Extended Data Abb. 5c, unten). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass PCO371 direkt an die intrazelluläre Wandlertasche bindet und als molekularer Keil fungiert (Extended Data Abb. 5d). Diese Bindungsposition stabilisiert die signifikante Auswärtsbewegung des intrazellulären Teils von TM6 ohne Signalausbreitung von der extrazellulären Seite, was sich von allen zuvor analysierten Klasse-B1-Agonisten und GPCR-Paaren unterscheidet.

Um einen Einblick in den Mechanismus der PCO371-induzierten PTH1R-Aktivierung zu erhalten, verglichen wir drei Schlüsselmotive unter GPCRs der Klasse B1: das aktive PYQ-Motiv (Pro6.47–Tyr6.53–Gln7.49); der PxxG-Schalter (Pro6.47–x–x–Gly6.50); und das inaktive HETY-Motiv (His2.50–Glu3.50–Thr6.42–Tyr7.59)17,26. An die orthosterische Tasche gebundenes PTH und allosterisch induzierte Umlagerung, um das Wasserstoffbrückenbindungsnetzwerk des aktiven PYQ-Motivs zu rekonstruieren (Extended Data Abb. 6a, b, links). Diese Konformationsänderungen erleichterten den scharfen Knick in TM6 bei Gly4186.50 im PxxG-Motiv und verlagerten Leu4166.48 und Phe4176.49 (Extended Data Abb. 6c, d). Die Bewegung von Leu4166.48 und Phe4176.49 erzeugte einen hydrophoben Cluster und stabilisierte die äußere Konformation der intrazellulären Hälfte von TM6 (Extended Data Abb. 6d). Infolgedessen drückte das verlagerte Leu4166.48 Tyr4597.59, wodurch das inaktive HETY-Motiv kollabierte und der intrazelluläre Hohlraum für die G-Protein-Unterbringung geöffnet wurde (Extended Data Abb. 6e).

Die TMD von PCO371-gebundenem PTH1R verformte das aktive PYQ-Motiv und den PxxG-Schalter von TM6 in der helikalen Struktur auf ähnliche Weise wie die ePTH-gebundene PTH1R-Struktur (Abb. 2e und 3a – c und erweiterte Daten Abb. 6f, g). ). Im Gegensatz zu den inaktiven Konformationen der aktiven PYQ- und PxxG-Motive kollidierten Trifluormethoxyphenyl und die Spiroimidazolongruppen von PCO371 (Abb. 1d) stark mit Val4126.44–Phe4176.49 und dem inaktiven HETY-Motiv in der ePTH-gebundenen PTH1R-Struktur bzw. (Extended Data Abb. 6h,i). Um dieses sterische Problem zu vermeiden, zeigte unsere Struktur, dass TM6 in PCO371-gebundenem PTH1R bei Pro4156.47 abgewickelt wurde, was darauf hinweist, dass dieser Rest für die PCO371-spezifische Aktivierung von PTH1R notwendig ist. In Übereinstimmung mit diesen strukturellen Beobachtungen reduzierte eine Mutation im PYQ-Motiv (Q4517.49A) und im PxxG-Schalter (L4166.48A, F4176.49A und G4186.50L) selektiv die PTH-induzierte cAMP-Akkumulation, hatte jedoch keinen Einfluss auf die PCO371-Aktivität ( Abb. 3d und erweiterte Daten Abb. 7). Im Gegensatz dazu hob die P4156.47L-Mutation die PCO371-Aktivität selektiv und vollständig auf, zeigte jedoch keinen signifikanten Effekt auf die PTH-Aktivität (Abb. 3d und erweiterte Daten Abb. 7). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Pro4156.47 für die PCO371-vermittelte Aktivierung von PTH1R ohne die Konformationsumlagerung des PYQ-Motivs und des PxxG-Schalters essentiell ist.

a, TMD-Region von PCO371-gebundenem PTH1R. b,c, Vergrößerte Ansicht des aktiven PYQ-Motivs und des aktiven PxxG-Schalters. d, GloSensor cAMP-Reaktionen in Wildtyp (WT) PTH1R und dem PYQ-Motiv oder den PxxG-Switch-Mutanten nach PTH- oder PCO371-Stimulation. Die negativen logarithmischen halbmaximalen effektiven Konzentrationswerte (pEC50) und die maximalen Reaktionswerte (Emax) wurden aus den Konzentrations-Reaktionskurven berechnet (Extended Data Abb. 7a, c). *P < 0,05 und **P < 0,01, berechnet unter Verwendung der Zwei-Wege-Varianzanalyse (ANOVA), gefolgt von Dunnetts Test für Mehrfachvergleichsanalyse (in Bezug auf den WT). NS, kein signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen. e, Überlagerung von PCO371-PTH1R-Gs, Isoproterenol-β1-Adrenalinrezeptor (β1AR)-Gs und Formoterol-β1AR-β-Arrestin-Komplexen, ausgerichtet auf TM2–TM5. Schwarze Pfeile zeigen die charakteristischen Konformationsänderungen von TM5 und TM6 in Gs-gebundenen und β-Arrestin-gebundenen Strukturen (links). PCO371 kollidiert mit TM6 im gestrichelten Kreis (Mitte und rechts). f, Konzentrations-Reaktionskurven der Rekrutierung von β-Arrestin 1 und β-Arrestin 2 für PTH1R nach Stimulation mit PTH oder PCO371. g, Co-Lokalisierung von PTH1R-β-Arrestin 2 als Reaktion auf PCO371 und unterschiedliche PTH-Konzentrationen. Quantifizierung der Co-Lokalisierung von PTH1R und β-Arrestin 2 nach Stimulation mit Vehikel, 100 nM PTH, 10 pM PTH oder 100 µM PCO371. Der Co-Lokalisierungsindex für einzelne Zellen in jeder Stimulationsbedingung wurde mithilfe von Fiji (ImageJ) berechnet. Symbole und Fehlerbalken stellen den Mittelwert bzw. den Halbwert von 10–19 Zellen dar. *P < 0,05 und **P < 0,01, berechnet unter Verwendung einer einfaktoriellen ANOVA, gefolgt von Dunnetts Test für eine Mehrfachvergleichsanalyse in Bezug auf die Fahrzeugstimulation. Die Daten stammen aus drei unabhängigen Experimenten (d,f).

Quelldaten

Im Allgemeinen ist die TM6-Konformation entscheidend für die bevorzugte Bindung spezifischer Wandler und die voreingenommene Signalübertragung. Frühere Studien haben gezeigt, dass die bevorzugte Bindung von G-Proteinen eine deutliche Auswärtsbewegung von TM6 und einen großen intrazellulären Hohlraum erfordert, während sie für β-Arrestine eine leichte Auswärtsbewegung von TM6 und einen kleinen intrazellulären Hohlraum erfordert27,28,29. PCO371 fungiert als molekularer Keil, der die deutlich nach außen gerichtete Konformation von intrazellulärem TM6 stabilisiert (Abb. 3e und erweiterte Daten Abb. 5d und 8a, b), was darauf hindeutet, dass PCO371 bevorzugt G-Proteine anstelle von β-Arrestinen aktiviert. In Übereinstimmung mit unseren strukturellen Erkenntnissen zeigten die NanoBiT-basierten Tests, dass die PCO371-Bindung vernachlässigbare Rekrutierungssignale für β-Arrestin 1 und β-Arrestin 2 hervorrief (Abb. 3f). Um anschließend gründlich zu zeigen, dass PCO371 ein G-Protein-abhängiger Agonist ist, beobachteten wir die intrazelluläre Translokation von PTH1R-β-Arrestin mittels konfokaler Mikroskopie. Wir exprimierten PTH1R, fusioniert mit einem Flag-Tag, und β-Arrestin 2, fusioniert mit mVenus, in HEK293-Zellen. Der Rezeptor wurde mit einem Alexa-647-fusionierten Flag-M1-Antikörper markiert und seine Membran- und subzelluläre Lokalisierung wurde durch konfokale Mikroskopie sichtbar gemacht. Die intrazelluläre Co-Lokalisierung von PTH1R und β-Arrestin 2 erfolgte 30 Minuten nach der Stimulation mit einer hohen Konzentration (100 nM) und einer niedrigen Konzentration (10 pM) von PTH (Abb. 3g und erweiterte Daten Abb. 8c). Im Gegensatz dazu wurde diese intrazelluläre Co-Lokalisierung nach Stimulation mit einer hohen Konzentration (100 µM) von PCO371 nicht beobachtet, was einer 10 pM PTH-Stimulation im cAMP-Assay entspricht (Abb. 3g und Extended Data Abb. 8c). Zusammenfassend kommen wir zu dem Schluss, dass PCO371 ein G-Protein-abhängiger Agonist ist. Unsere Studie liefert strukturelle Beweise dafür, dass der intrazelluläre Agonist PCO371 G-Proteine selektiv aktiviert und dass ein direkt beeinflusster Signalmechanismus ohne allosterische Signaltransduktion induziert werden kann.

Unsere Struktur zeigte, dass PCO371 mit der intrazellulären Tasche interagiert, die durch die hochkonservierten Reste von GPCRs der Klasse B1 (Arg2192.46, His2232.50, Leu2262.53, Ile2993.47, Glu3023.50, Leu3063.54, Val4126.44, Leu4136) gebildet wird .45, Met4146.46, Pro4156.47, Leu4166.48, Phe4176.49, Gly4186.50, Phe4547.52, Tyr4597.57 und Asn4638.47) (Abb. 4a, b). Um potenzielle Anwendungen im Zusammenhang mit dieser Tasche zu bewerten, haben wir mithilfe eines cAMP-Akkumulationstests die Mengen der PCO371-induzierten cAMP-Produktion in allen Klasse-B1-GPCRs gemessen. Bemerkenswerterweise aktivierte PCO371 7 von 15 GPCRs der Klasse B1 (Abb. 4c und erweiterte Daten Abb. 8d). Wir verglichen die GPCR-Sequenzähnlichkeit mithilfe einer phylogenetischen Baumanalyse30 (berechnet mit GPCRdb (https://gpcrdb.org/)) und stellten fest, dass PCO371 Rezeptoren aktiviert, die derselben Gruppe, der PTH1R-Klade, zugeordnet sind, mit Ausnahme von PTH2R und dem Glucagonrezeptor ( GCGR) (Abb. 4d).

a, TMD-Region von PCO371-gebundenem PTH1R (oben) und vergrößerte Ansicht der PCO371-Bindungsregion (Mitte und unten). b, Aminosäuresequenz-Alignment von GPCRs der menschlichen Klasse B1. Die beschriebenen Reste interagieren mit PCO371. c, PCO371-induzierte GloSensor-cAMP-Reaktionen unter GPCRs der Klasse B1. Die Werte im Radardiagramm geben die logarithmischen Werte der relativen intrinsischen Aktivität (∆log RIAPCO-Peptid) an, die als Emax/EC50-Wert (RIAPCO) in jedem Rezeptor, normalisiert durch den Emax/EC50-Wert nach Stimulation durch seine endogenen Peptidagonisten, definiert ist (RIApeptid). Linien und schattierte Bereiche stellen den Mittelwert bzw. den Halbwert von drei unabhängigen Experimenten dar, die jeweils doppelt durchgeführt wurden. Beachten Sie, dass in acht PCO371-unempfindlichen GPCRs (PTH2R, GIPR, GLP-2R, GLP-1R, CRF1R, CRF2R, CALCR und CALRL) die RIAPCO-Werte nicht berechnet werden konnten. Daher werden die ∆log RIAPCO-Peptidwerte mit weniger als −7 angegeben. d, Phylogenetischer Baum der GPCRs der Klasse B1. PCO371-empfindliche und PCO371-unempfindliche Rezeptoren sind durch rote bzw. blaue Linien gekennzeichnet. PCO371 aktiviert Mitglieder der PTH1R-Klade, mit Ausnahme von PTH2R und GCGR. e, Konzentrations-Reaktionskurven der GloSensor cAMP-Reaktionen von WT und L3706.47P-Mutant (L370P) PTH2R nach Stimulation mit PTH oder PCO371. Symbole und Fehlerbalken stellen den Mittelwert bzw. den Halbwert von drei unabhängigen Experimenten dar, die in zweifacher Ausfertigung durchgeführt wurden.

Um herauszufinden, warum PCO371 PTH2R nicht aktivieren konnte, untersuchten wir den nicht konservierten Leucinrest an Position 6,47. Angesichts der Tatsache, dass GPCRs der Klasse B1 weitgehend den Prolinrest an Position 6,47 annehmen, der eine entscheidende Rolle bei der PCO371-Erkennung von PTH1R spielt (Abb. 3d und erweiterte Daten Abb. 6f), haben wir untersucht, ob die fehlende Reaktion auf PCO371 durch den Unterschied verursacht wird Aminosäure an der Position 6,47 in PTH2R. In Übereinstimmung mit unserer Hypothese erzeugte die PTH2R-Mutante L3706.47P als Reaktion auf PCO371 eine cAMP-Akkumulation (Abb. 4e und erweiterte Daten Abb. 8e). In Anbetracht der Tatsache, dass PTH sowohl Wildtyp- als auch P4156.47L-PTH1R aktivierte, wohingegen PCO371 P4156.47L-PTH1R nicht aktivierte (Abb. 3d), kamen wir zu dem Schluss, dass Pro6.47 eine wesentliche Determinante für die PCO371-induzierte Rezeptoraktivierung ist.

Unsere Arbeit ergab, dass PCO371 ein vielseitiger Agonist für sieben GPCRs der Klasse B1 ist (Abb. 4c, d), was darauf hindeutet, dass dieser oral verfügbare Medikamentenkandidat der Phase 1 ein vielversprechender Wirkstoffkeim für die gezielte Bekämpfung dieser Rezeptoren sein könnte. Es bleiben jedoch Fragen zur Rezeptorselektivität von PCO371 zwischen der PAC1R-Klade und der GLP-1R-Klade (Abb. 4d). Basierend auf Strukturvergleichen mit Verbindung 2-gebundenem GLP-1R spekulieren wir, dass die gleichzeitige Bewegung der extrazellulären und intrazellulären Hälften von TM6 ein Schlüsselmerkmal für die spezifische Aktivierung ist. Verbindung 2 ist ein intrazellulärer Agonist, der an die Außenseite von intrazellulärem TM6 bindet (Extended Data Abb. 9a,b, links). Die Verbindung-2-gebundene GLP-1R-Struktur zeigte den typischen scharfen Knick in TM6, ähnlich den orthosterischen Peptid-gebundenen aktiven Strukturen11 (Abb. 2e und erweiterte Daten Abb. 9b, c). Die extrazelluläre Konformation von GLP-1R wird vermutlich im Zusammenhang mit der Konformationsänderung auf der intrazellulären Seite neu angeordnet. Obwohl diese von innen nach außen gerichtete Konformationsänderung in GLP-1R ein häufiges Merkmal ist, das bei anderen GPCRs, wie z. B. GPCRs der Klasse A, beobachtet wird, wurde bei PCO371-gebundenem PTH1R keine extrazelluläre Konformationsänderung beobachtet. Daher schlugen wir vor, dass PCO371 nur eine Gruppe von GPCRs aktiviert, die für die Rezeptoraktivierung keinen Inside-Out-Wechsel von TM6 erfordern, da PCO371 nicht in der Lage ist, Rezeptoren zu binden, die die typischerweise aktivierte extrazelluläre Konformation annehmen (Abb. 2d). Um diese Hypothese zu beweisen, haben wir drei chimäre Rezeptoren entworfen – PTH1R (TM6 ersetzt durch GLP-1R), PTH1R (TM6 ersetzt durch PAC1R) und GCGR (TM6 ersetzt durch GLP-1R) – und die induzierte cAMP-Produktion gemessen von PCO371. Bemerkenswerterweise zeigten diese Rezeptoren nur geringfügige Unterschiede in ihren endogenen Ligandenreaktionen, was darauf hindeutet, dass diese chimären Rezeptoren ihre Rezeptoraktivitäten beibehalten (Extended Data, Abb. 9d). Darüber hinaus hat PTH1R (TM6-GLP-1R) die cAMP-Produktion durch PCO371 vollständig aufgehoben, wohingegen PTH1R (TM6-PAC1R) eine unterscheidbare cAMP-Produktion durch PCO371 zeigte (Extended Data Abb. 9d). In Übereinstimmung mit unserer Annahme fehlte GCGR (TM6-GLP-1R) auch größtenteils die cAMP-Produktion durch PCO371 (Extended Data Abb. 9d). Diese Ergebnisse stützen nachdrücklich unseren Vorschlag, dass PCO371 Rezeptoren aktiviert, die unabhängig voneinander die intrazelluläre Hälfte von TM6 von der extrazellulären Hälfte mobilisieren können.

In dieser Studie haben wir eine neue intrazelluläre agonistische Tasche von PTH1R und einen atypischen Aktivierungsprozess identifiziert, bei dem PCO371 als molekularer Keil fungiert. Zuvor berichtete GPCR-Strukturen der Klasse B1 haben die gemeinsamen Mechanismen der allosterischen Signaltransduktion durch Peptide und kleine chemische Agonisten offenbart, die an die orthosterische Stelle binden, obwohl sich die Bindungsmodi zwischen chemischen Agonisten und Peptidagonisten unterscheiden (Extended Data Abb. 4 und 5). Im Gegensatz zu diesen zuvor beschriebenen Liganden bindet PCO371 direkt an die intrazelluläre Transducer-Tasche von PTH1R und aktiviert diese, ohne dass eine allosterische Signaltransduktion von der extrazellulären Seite erforderlich ist (Abb. 5). Diese Ergebnisse legen nahe, dass PCO371 die Zellmembran erfolgreich durchquert und wie ein Membranlipid direkt auf die intrazelluläre Seite oder den Intramembranbereich zugreift (Abb. 5). Anstatt den typischen scharfen Knick in TM6 bei Gly4186.50 auszulösen, wickelt PCO371 TM6 bei Pro4156.47 ab, was für seine Aktivität notwendig ist (Abb. 3e und 5 und erweiterte Daten Abb. 6b, f). Unsere Studie enthüllte einen eindeutigen Mechanismus für die GPCR-Aktivierung, der das Potenzial für Arzneimittelentwicklungsstrategien erweitert.

Der ausgeprägte Aktivierungs- und funktionelle Selektivitätsmechanismus von PTH1R. Oben induziert PTH die Neuordnung der extrazellulären Teile von TM1, TM6 und TM7, was die Auswärtsbewegung des intrazellulären Teils von TM6 und die Bildung eines Knicks bei Gly4186.50 verursacht. PTH-gebundenes PTH1R kann bevorzugte Konformationen für G-Proteine bzw. β-Arrestine annehmen. Unten bewegt PCO371 den intrazellulären Teil von TM6 direkt nach außen und verursacht die Bildung eines moderaten Knicks in TM6 bei Pro4156.47, ohne dass eine extrazelluläre Neuanordnung erforderlich ist. PCO371-gebundenes PTH1R nimmt ausschließlich die bevorzugte Konformation für G-Proteine an, indem es die äußere Konformation des intrazellulären Teils von TM6 stabilisiert. ECD, extrazelluläre Domäne.

Intrazelluläre Ligandentaschen haben in der GPCR-Pharmakologie großes Interesse geweckt, da sie das Potenzial haben, selektiv mit spezifischen Signalwandlern zu interagieren und diese zu aktivieren. Bisher wurden die Strukturen mehrerer Antagonisten, positiver allosterischer Modulatoren und eines vorallosterischen Modulators im Komplex mit ihren entsprechenden GPCRs beschrieben 1,4,5,6,11,12 (erweiterte Abb. 9a). Obwohl diese Liganden an die intrazelluläre Region jedes GPCR binden, gibt es keine Struktur, die einen Agonisten in der intrazellulären Wandlertasche aufnimmt, was strukturelle Einblicke in die voreingenommene Signalübertragung von der intrazellulären Seite einschränkt. Unsere Struktur bietet einen detaillierten Überblick über einen Agonisten, der in der intrazellulären Höhle gebunden ist und direkt mit einem G-Protein interagiert. Da G-Proteine eine offene Hohlraumkonformation benötigen, während β-Arrestine eine geschlossene Konformation bevorzugen 27, 28, 29, wird die Größe dieses Hohlraums als ausschlaggebend für einen voreingenommenen Agonismus angesehen (Abb. 3g – i und erweiterte Daten Abb. 8a, b). ). G-Protein-abhängiger Agonismus ist für die Arzneimittelentwicklung mit Klasse-B1-GPCRs von Vorteil, da die durch Klasse-B1-GPCR vermittelte β-Arrestin-Aktivierung im Allgemeinen eine verlängerte Signalübertragung durch das frühe Endosom induziert, was zu unerwünschten Wirkungen führt31. PCO371 interagiert direkt mit dem C-terminalen Haken von Gαs, der unterschiedliche Sequenzen zwischen den Gα-Untereinheiten aufweist. Somit können Modifikationen von PCO371 eine weitere selektive Funktionalität zwischen G-Protein-Subtypen erlangen (Extended Data Abb. 9e, f).

Um die PCO371-Empfindlichkeit in GPCRs der Klasse B1 weiter zu analysieren, haben wir zuvor gemeldete endogene ligandengebundene aktive GPCRs der Klasse B1 überlagert und sorgfältig untersucht. Wir haben eine alternative Konformation von Asn5.50 zwischen GCGR und Magen-inhibitorischem Polypeptidrezeptor (GIPR) festgestellt, die genetisch ähnlich ist, jedoch eine unterschiedliche Empfindlichkeit für PCO371 aufweist (Erweiterte Daten, Abb. 10a, b). Die überlagerten GPCR-Strukturen der aktiven Klasse B1 zeigten, dass die PCO371-unempfindlichen Rezeptoren die nach außen gerichtete Asn5.50-Konformation in Richtung TM3 annahmen, während die PCO371-empfindlichen Rezeptoren die nach innen gerichtete Konformation in Richtung der Mitte des Rezeptors annahmen (Abb. 4d und erweiterte Daten Abb. 10c). ). Wir führten außerdem drei unabhängige Molekulardynamiksimulationen durch, ausgehend von unserer PCO371-gebundenen PTH1R-Kryo-EM-Struktur, und analysierten die Funktionalität von Asn5.50 für die PCO371-Erkennung. Diese Simulationen zeigten, dass die TMD des Rezeptors eine aktive Konformation ähnlich der Kryo-EM-Struktur beibehielt und PCO371 stabil an den Rezeptor gebunden war (Extended Data Abb. 10d, obere zwei Felder). Die Asn5.50-Konformation war in ihrer Position in unserer PCO371-gebundenen PTH1R-Kryo-EM-Struktur stabil, die sich von der der aktiven GLP-1-gebundenen GLP-1R-Struktur unterscheidet (Protein Data Bank (PDB)-Kennung: 6X18) ( Erweiterte Daten Abb. 10d, zweiter von unten, und 10e). Bemerkenswerterweise zeigte der Rezeptor im zweiten Durchgang einen Zwischenzustand und PCO371 erzeugte eine neue und stabile Wechselwirkung mit Asn3745.50 (Extended Data Abb. 10d, unten, 10f, g). In Übereinstimmung mit der Simulation reduzierte die PTH1R-Mutante N3745.50A selektiv die PCO371-induzierte Rezeptoraktivierung, wohingegen diese Mutante keinen Einfluss auf die PTH-induzierte Rezeptoraktivierung hatte (Extended Data Abb. 10h). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Seitenkettenorientierung von Asn3745.50 für die PCO371-Erkennung entscheidend ist und dass Asn3745.50 auf PCO371 reagieren kann, wenn seine Seitenkette in Richtung der Mitte des Rezeptors ausgerichtet ist (Extended Data Abb. 10a – c). In Kombination mit unseren Molekulardynamiksimulationen und Funktionsstudien legen diese Ergebnisse nahe, dass Asn5.50 eine der Determinanten für die Erkennung und Empfindlichkeit von PCO371 in GPCRs der Klasse B1 ist. In Zukunft könnte die Struktur des PCO371-gebundenen GCGR ein umfassendes Verständnis der Rezeptorselektivität von PCO371 liefern.

Bei der Arzneimittelentwicklung ist die Rezeptorspezifität entscheidend für die therapeutische Wirksamkeit und Sicherheit. Bei GPCRs weist der TMD-Kern eine hohe Sequenzähnlichkeit auf, wohingegen die extrazellulären und intrazellulären Schleifen unterschiedliche Sequenzen aufweisen. Diese Unterschiede deuten darauf hin, dass Agonisten an Rezeptorselektivität gewinnen, indem sie den Liganden zur Außenseite des Rezeptors hin ausdehnen32. Unsere Struktur ergab, dass der intrazelluläre Hohlraum von PCO371-gebundenem PTH1R durch Gs dicht verschlossen ist und PCO371 nicht mit den intrazellulären Schleifen interagieren kann (Extended Data Abb. 11a, b). Stattdessen ist die Ligandenbindungstasche von PCO371 seitlich zwischen TM6 und TM7 offen, was für Helix 8 zugänglich ist (Extended Data Abb. 11b, links). Darüber hinaus stellte unsere Struktur eine intrazelluläre Tasche dar, die aus TM1, TM7 und Helix 8 bestand und zur Membranregion hin ausgerichtet war. Angesichts der Tatsache, dass Helix 8 über Sequenzvielfalt verfügt, kann ein an diese Tasche gebundenes Bindemittelmolekül für Rezeptorselektivität sorgen, was zur Entwicklung eines bitopischen Liganden führt (Extended Data Abb. 11c, d). Darüber hinaus besitzt PTH1R einen nicht konservierten Cysteinrest an Position 7,60 auf der intrazellulären Schleife, der TM7 und Helix 8 verbindet (Extended Data Abb. 11c, rechts). Beachten Sie, dass nur PTH1R, PTH2R und CALCR den Cysteinrest an Position 7,60 haben und PCO371 CALCR und PTH2R nicht aktiviert. Somit kann die Hinzufügung einer kovalenten funktionellen Gruppe zu PCO371 eine Selektivität des PCO371-Rezeptors gegenüber PTH1R bewirken. Cβ von Cys7.60 liegt 6,4 Å von O6 von PCO371 entfernt (Extended Data Abb. 11c, rechts), und drei oder vier Kohlenstoffreste würden ausreichen, um PCO371 und Cys7.60 zu verbinden. Darüber hinaus könnten zuvor beschriebene kovalente Wirkstoffe (Verbindung 2)11 für GLP-1R auch bei der Erzeugung bitopischer Liganden nützlich sein. Verbindung 2 fungiert als schwaches kovalentes Bindungsmittel und bindet selektiv an Cys3476.36. Durch Optimierung der Bindung von Verbindung 2 an den durch TM6, TM7 und Gαs von PTH1R gebildeten Hohlraum kann eine modifizierte Verbindung 2–PCO371 zu einem PTH1R-selektiven Agonisten werden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die in dieser Studie identifizierte ausgeprägte intrazelluläre Wandlertasche ein großes Potenzial für die Entwicklung voreingenommener chemischer Verbindungen für Agonisten, Antagonisten und allosterische Modulatoren haben könnte. Unsere Ergebnisse werden das Gesamtverständnis der Mechanismen der GPCR-Aktivierung erweitern und neue Strategien für das Design und die Entwicklung von GPCR-zielgerichteten Therapeutika liefern.

Das für menschliches PTH1R kodierende Plasmid (GenBank-Kennung: U17418.1; Reste 27–491) wurde wie zuvor berichtet17 konstruiert und gereinigt. Das Konstrukt wurde in HEK293 GnTI-Zellen (N-Acetylglucosaminyltransferase I-negativ) (American Type Culture Collection, CRL-3022) unter Verwendung des BacMam-Systems (Thermo Fisher Scientific) exprimiert und die Zellen wurden in FreeStyle 293-Medium (Gibco) gezüchtet und gehalten. bei 37 °C, mit 8 % CO2 unter feuchten Bedingungen. Beachten Sie, dass die Zellen mit dem in Sf9-Zellen (Life Technologies) erzeugten Baculovirus infiziert, mit 10 mM Natriumbutyrat ergänzt wurden, um die Proteinexpression nach 18 Stunden zu steigern, und weitere 48 Stunden bei 30 °C in Suspension kultiviert wurden. Die kultivierten Zellen wurden durch Zentrifugation (5.000 g, 10 Min., 4 °C) gesammelt und durch Ultraschallbehandlung in einem hypotonischen Lysepuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl und 20 % Glycerin) aufgeschlossen. Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation (10.000 g, 10 Min., 4 °C) entfernt. Die Membranfraktion wurde durch einstündige Ultrazentrifugation bei 180.000 g gesammelt und in einem Solubilisierungspuffer (20 mM Tris-HCl, pH 9,0, 200 mM NaCl, 1 % LMNG, 0,1 % CHS, 20 % Glycerin und 100 μM PCO371) solubilisiert. für 2 Stunden bei 4 °C. Die solubilisierten Rezeptoren wurden vom unlöslichen Material durch Ultrazentrifugation bei 180.000 g für 20 Minuten getrennt und mit Ni-NTA-Harz (Qiagen) für 30 Minuten inkubiert. Waschmittelmizellen wurden durch Waschen mit 20 Säulenvolumina Waschpuffer (20 mM Tris-HCl, pH 9,0, 500 mM NaCl, 0,03 % GDN, 10 % Glycerin, 100 μM PCO371 und 30 mM Imidazol) ersetzt. Der Rezeptor wurde in Elutionspuffer (20 mM Tris-HCl, pH 9,0, 500 mM NaCl, 0,01 % GDN, 10 % Glycerin, 100 μM PCO371 und 300 mM Imidazol) eluiert. Das Eluat wurde mit TEV-Protease behandelt, um den GFP-His10-Tag zu spalten, und gegen Dialysepuffer (20 mM Tris-HCl, pH 9,0, 500 mM NaCl, 100 μM PCO371 und 10 % Glycerin) dialysiert. Die abgespaltenen GFP-His10-Tags und die TEV-Proteasen wurden mit Ni-NTA-Harz entfernt. Der Rezeptor wurde durch Größenausschlusschromatographie auf einer Superdex 200 10/300-erhöhungssäule gereinigt, äquilibriert in SEC-Puffer (20 mM Tris-HCl, pH 9,0, 150 mM NaCl, 0,01 % GDN und 100 μM PCO371). Die Peakfraktionen wurden gesammelt und auf etwa 5 mg ml–1 konzentriert.

Das für Mini-Gs kodierende Plasmid wurde wie zuvor berichtet34 konstruiert und gereinigt. Mini-Gs wurde in Escherichia coli (BL21)-Zellen exprimiert. Die Zellen wurden in LB-Medium, ergänzt mit 1 mM Isopropyl-β-d-thiogalactopyranosid (IPTG), bei 25 °C kultiviert. Nach 20 Stunden wurden die Zellen durch Ultraschall in hypotonischem Puffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2 und 1 μM GDP) aufgeschlossen und das Mini-Gs-Protein durch Ni-NTA-Affinitätschromatographie gereinigt und dann einer Größenausschlusschromatographie auf einer HiLoad Superdex75 16/600-Säule unterzogen.

His6-Tag-fusioniertes Ratten-Gβ1 und Rinder-Gγ2 wurden ebenfalls wie zuvor berichtet konstruiert, exprimiert und gereinigt17. Zellkulturen wurden 60 Stunden lang bei 27 °C in Sf900 II-Medium (Gibco) bis zu einer Zelldichte von 4 × 106 Zellen pro ml gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt und in hypotonischem Puffer lysiert. Das Gβ1-Gγ2-Heterodimer wurde durch Ni-NTA-Affinitätschromatographie gereinigt und anschließend einer Größenausschlusschromatographie auf einer HiLoad Superdex75 16/600-Säule unterzogen.

Die gereinigten Mini-Gs und Gβ1–Gγ2 wurden gemischt und über Nacht auf Eis inkubiert. Die Mischung wurde konzentriert und auf eine Superdex 75 10/300-Größenausschlusssäule geladen und in Puffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl und 1 μM GDP) äquilibriert. Peakfraktionen, die das Mini-Gs-Heterotrimer enthielten, wurden gepoolt und auf 5 mg ml–1 konzentriert.

Das für Nb35 kodierende Plasmid wurde wie zuvor berichtet17,35 hergestellt. Das Protein wurde im Periplasma von E. coli C41 (Rosetta)-Zellen exprimiert, die in LB-Medium, ergänzt mit 1 mM IPTG, 20 Stunden lang bei 25 °C kultiviert wurden. Nach 20 Stunden wurden die Zellen gesammelt und durch Ultraschallbehandlung in hypotonischem Puffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl und 2 mM MgCl2) aufgeschlossen, und das Nb35-Protein wurde durch Ni-NTA-Affinitätschromatographie gereinigt und dann unterzogen Größenausschlusschromatographie auf einer HiLoad Superdex75 16/600-Säule. Peakfraktionen wurden gepoolt und auf 3 mg ml–1 konzentriert.

PCO371 wurde bei Chugai Pharmaceutical synthetisiert und seine Reinheit und Stabilität wurde durch Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie bestätigt. Die gereinigten PCO371-gebundenen PTH1R-Proteine wurden mit einem 1,2-fachen molaren Überschuss an Mini-Gsβ1γ2 und einem 1,5-fachen molaren Überschuss an Nb35 gemischt und die Mischung über Nacht bei pH 9,0 auf Eis inkubiert. Die Probe wurde mit Ni-NTA-Affinitätsharz gereinigt und auf eine Superdex 200 10/300-Größenausschlusssäule geladen, äquilibriert in Puffer (20 mM Tris-HCl, pH 9,0, 150 mM NaCl, 0,01 % GDN und 100 μM PCO371). um den Komplex von Verunreinigungen zu trennen. Spitzenfraktionen des PCO371-PTH1R-mini-Gs-Heterotrimer-Nb35-Komplexes wurden gepoolt und auf 7 mg ml–1 konzentriert.

Der gereinigte Komplex wurde mit einem Vitrobot Mark IV bei 4 °C und 100 % Luftfeuchtigkeit auf ein frisch glimmentladenes Quantifoil-Lochkohlenstoffgitter (R1,2/1,3, Au, 300 Mesh) aufgetragen. Die vorbereiteten Gitter wurden auf ein Titan Krios G4-Mikroskop (Thermo Fisher Scientific) übertragen, das bei einer Beschleunigungsspannung von 300 kV mit einem Gatan Quantum-LS Energy Filter (GIF) und einem Gatan K3 Summit-Direktelektronendetektor im Nanosonden-EFTEM-Modus betrieben wurde. Die Bilder wurden mit einer Nennvergrößerung von 105 K aufgenommen, was einer kalibrierten Pixelgröße von 0,83 Å pro Pixel entspricht (Universität Tokio, Japan). Der Datensatz wurde mit der Software Serial EM (v.3.7.4) mit einem Defokusbereich von –0,8 bis –1,6 μm erfasst. Jedes Bild wurde in 72 Bilder mit einer Dosisrate von 7,5 e−pixel−1 s−1 dosisfraktioniert, um eine Gesamtdosis von 54,578 e−Å−2 zu erreichen. Die 6.333 dosisfraktionierten Filme wurden einer strahlinduzierten Bewegungskorrektur mit RELION-3 (Ref. 36) unterzogen und die Kontrastübertragungsfunktion und die Defokussierungsparameter wurden mit CTFFIND4 (Ref. 37) geschätzt. Die 4.880.293 Partikel wurden ursprünglich aus den 6.333 Mikroaufnahmen mithilfe der Laplace-of-Gaussian-Picking-Funktion in RELION-3 ausgewählt und mit 3,63 Å pro Pixel extrahiert. Diese Partikel wurden mehreren Runden der 2D- und 3D-Klassifizierung unterzogen. Die beste Klasse enthielt 109.422 Partikel, die dann mit einer Pixelgröße von 1,11 Å pro Pixel erneut extrahiert und einer 3D-Verfeinerung unterzogen wurden. Die homogene Teilmenge wurde einer Defokussierungsverfeinerung pro Partikel, einer Strahlneigungsverfeinerung, einem Bayes'schen Polieren und einer 3D-Verfeinerung unterzogen. Die abschließende 3D-Verfeinerung und Nachbearbeitung ergab Karten mit einer globalen Auflösung von 2,9 Å gemäß dem Fourier-Shell-Korrelationskriterium = 0,143. Die Verarbeitungsstrategie ist in Extended Data Abb. 2 beschrieben.

Die ursprüngliche Vorlage für den PTH1R-Gs-Nb35-Komplex wurde aus der PTH-PTH1R-Gs-Nb35-Struktur abgeleitet (PDB-Kennung: 7VVL), gefolgt von einer umfassenden Umgestaltung mit COOT-0.9.3 EL38. Die Modelle von PCO371–PTH1R–Gs wurden mit COOT manuell neu angepasst, mit phenix.real_space_refine (v.1.14-3260)39 REFMAC540 und Servalcat41 anhand der Arbeitskarten verfeinert und in MolProbity42 validiert.

Das System umfasste PTH1R, PCO371, 1-Phosphoryl-2-oleoylphosphatidylcholin (POPC), TIP3P-Wasser und 150 mM NaCl. Das ursprüngliche Modell von PTH1R mit den Aminosäuren 27–491 wurde mit MODELLER (v.10.1)43 erstellt, wobei die Kryo-EM-Struktur von PTH1R im Komplex mit PCO371 als Vorlage diente. Die fehlenden Wasserstoffatome wurden mit dem Programm VMD (v.1.9.3)44 aufgebaut. Das Protein wurde mithilfe der MemProtMD-Pipeline45 in die POPC-Membran eingebettet. Die Nettoladung des Simulationssystems wurde durch Zugabe von 150 mM NaCl neutralisiert. Das Simulationssystem war 96 × 96 × 180 Å3 groß und enthielt 123.567 Atome. Für die Protein-, Lipid- und Wassermoleküle wurden die molekularen Topologien und Parameter aus dem Charmm36-Kraftfeld46 verwendet. Die molekulare Topologie und Parameter für PCO371 wurden mit dem CHARMM-GUI-Ligandenleser und -Modellierer47,48 erstellt.

Molekulardynamiksimulationen wurden mit dem Programm NAMD (v.2.13) durchgeführt. Die Simulationssysteme wurden für 1.000 Schritte mit festen Positionen der Nichtwasserstoffatome energieminimiert. Nach der Minimierung wurden weitere 1.000 Schritte der Energieminimierung mit Einschränkungen von 10 kcal mol−1 für die Nichtwasserstoffatome durchgeführt, mit Ausnahme der Lipidmoleküle innerhalb von 5,0 Å von den Proteinen. Als nächstes wurden Äquilibrierungen für 0,1 ns unter NVT-Bedingungen durchgeführt, mit 10 kcal mol−1 Å−2 Restriktionen für die schweren Atome der Proteine. Abschließend wurde die Äquilibrierung für 2,0 ns unter NPT-Bedingungen durchgeführt, mit den Beschränkungen von 1,0 kcal mol−1 Å−2 für alle Cα-Atome der Proteine. Die Produktionsläufe wurden 200 ns lang ohne Einschränkungen durchgeführt, während eine konstante Temperatur von 310 K unter Verwendung der Langevin-Dynamik und ein konstanter Druck bei 1 atm unter Verwendung eines Nosé-Hoover-Langevin-Kolbens 49,50 aufrechterhalten wurden. Die weitreichenden elektrostatischen Wechselwirkungen wurden mit der Partikelnetz-Ewald-Methode50 berechnet. Die Simulationen wurden dreimal unabhängig voneinander durchgeführt. Die Simulationsergebnisse wurden mit mdtraj (v.1.9.8)51, seaborn (https://zenodo.org/record/54844) und CUEMOL (v.2.2.3.443) (http://www.cuemol) analysiert und visualisiert. org).

Die PTH1R-induzierte Gs-Aktivierung wurde mit dem GloSensor cAMP-Akkumulationstest gemessen. Wir konstruierten zunächst ein Plasmid, bei dem das menschliche PTH1R-Gen in voller Länge N-terminal mit dem Flag-Epitop-Tag mit der vorhergehenden, von Hämagglutinin abgeleiteten Signalsequenz fusioniert wurde. HEK293A-Zellen wurden in einer 6-cm-Kulturschale mit einer Konzentration von 2 × 105 Zellen pro ml (4 ml pro Vertiefung in DMEM (Nissui Pharmaceutical), ergänzt mit 10 % FBS (Sigma, F7524, Charge 0001641439) und Penicillin-Streptomycin- ausgesät. Glutamin (komplettes DMEM) 1 Tag vor der Transfektion. Die Transfektionslösung wurde hergestellt, indem 10 μl (im Folgenden pro Vertiefung) 1 mg ml–1 Polyethylenimin-MAX-Lösung (Polysciences) und eine Plasmidmischung bestehend aus 1.000 ng Glo-22F-cAMP-Biosensor (humanes Codon optimiert und gensynthetisiert) kombiniert wurden. kodierend für pCAGGS-Plasmide und 400 ng Flag-PTH1R-Plasmide in 400 µl Opti-MEM (ThermoFisher Scientific). Nach 24-stündiger Inkubation wurden transfizierte Zellen unter Verwendung von 0,53 mM EDTA-haltigem Dulbecco-PBS (D-PBS) gesammelt, zentrifugiert und in 2 ml HBSS mit 0,01 % BSA (fettsäurefreie Qualität; SERVA) und 5 mM HEPES suspendiert (pH 7,4) (Testpuffer). Die Zellsuspension wurde in einer weißen Platte mit 96 Vertiefungen in einem Volumen von 40 μl pro Vertiefung verteilt und mit 10 μl einer 10 mM d-Luciferin-Kaliumlösung (FujiFilm Wako Pure Chemical), verdünnt in Testpuffer, beladen. Nach 2-stündiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Grundlumineszenz der Platte gemessen (SpectraMax L ausgestattet mit 2PMT, Molecular Devices; SoftMax Pro (v.7.03), Molecular Devices) und 20 μl 6-facher Ligand, verdünnt im Testpuffer oder Der Testpuffer allein (Vehikel) wurde manuell hinzugefügt. Die Platte wurde 20 Minuten lang im Abstand von 30 Sekunden bei Raumtemperatur abgelesen. Die Lumineszenzzahlen über 8–10 Minuten nach der Ligandenzugabe wurden gemittelt und auf die Anfangszahlen normiert, und die fachen Änderungen in den Signalen während der Vehikelbehandlung wurden weiter auf Forskolin (10 µM) normiert und für die cAMP-Akkumulationsreaktion aufgezeichnet. Unter Verwendung der Prism 9-Software (GraphPad) wurde die Antwort mithilfe der nichtlinearen Regression an alle Daten angepasst. Es wurde die variable Steigung (vier Parameter) im Tool Prism 9 mit einer Beschränkung der Hill-Steigung mit einem Absolutwert von weniger als 2 verwendet. pEC50- und Emax-Werte wurden aus der nichtlinearen Regressionskurve der gemittelten Daten erhalten. Für die Mehrfachvergleichsanalyse wurde eine einfaktorielle oder zweifaktorielle ANOVA und anschließend der Dunnett-Test verwendet.

Die β-Arrestin-Rekrutierung für PTH1R wurde mit geringfügigen Modifikationen mithilfe des NanoBiT β-Arrestin-Rekrutierungstests52 gemessen. Kurz gesagt, die Plasmidtransfektion wurde in einer 6-cm-Kulturschale mit einer Mischung aus 200 ng N-terminalem großem BiT-fusioniertem β-Arrestin 1 (Lg-β-Arrestin 1) oder Lg-β-Arrestin 2 und 1.000 ng C durchgeführt -terminale kleine BiT-fusionierte PTH1R (PTH1R-Sm)-Plasmide. Nach 24-stündiger Inkubation wurden die transfizierten Zellen mit 0,53 mM EDTA-haltigem D-PBS gesammelt, 5 Minuten bei 190 g zentrifugiert und in 4 ml des für den GloSensor-Assay beschriebenen Testpuffers suspendiert. Die Zellsuspension wurde in einer weißen Platte mit 96 Vertiefungen in einem Volumen von 80 μl pro Vertiefung (im Folgenden Platte mit 96 Vertiefungen) verteilt und mit 20 μl 50 μM Coelenterazin (Carbosynth), verdünnt im Testpuffer, beladen. Nach 2-stündiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Grundlumineszenz der Platte gemessen (SpectraMax L ausgestattet mit 2PMT, Molecular Devices; SoftMax Pro (v.7.03), Molecular Devices) und 20 μl 6-facher Ligand, verdünnt im Testpuffer oder Fahrzeug wurde manuell hinzugefügt. Die Platte wurde 15 Minuten lang im Abstand von 40 Sekunden bei Raumtemperatur abgelesen. Die Lumineszenzzählungen 13 bis 15 Minuten nach der Ligandenzugabe wurden gemittelt und auf die anfänglichen Zählungen normalisiert. Die Antwort wurde mit dem gleichen Verfahren wie für den GloSensor-Assay an alle Daten angepasst.

Die Zelloberflächenexpression von PTH1R wurde mit einer zuvor beschriebenen Durchflusszytometriemethode gemessen17. Kurz gesagt, HEK293A-Zellen wurden einen Tag vor der Transfektion in einer Kulturplatte mit 6 Vertiefungen in einer Konzentration von 2 × 105 Zellen pro ml ausgesät. Die Transfektion erfolgte nach dem gleichen Verfahren wie für den GloSensor-Assay beschrieben. Einen Tag nach der Transfektion wurden die Zellen durch Zugabe von 100 μl 0,53 mM EDTA-haltigem D-PBS und dann 100 μl 5 mM HEPES (pH 7,4) enthaltendem HBSS gesammelt. Die Zellsuspension wurde in eine V-Bodenplatte mit 96 Vertiefungen überführt und mit einem monoklonalen Anti-Flag-Epitop-Tag (DYKDDDDK)-Antikörper (Klon 1E6, FujiFilm Wako Pure Chemicals; 10 μg ml–1 verdünnt in 2 % Ziegenserum) fluoreszierend markiert 2 mM EDTA-haltiges D-PBS (Blockierungspuffer) und ein Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L)-Sekundärantikörper, konjugiert mit Alexa Fluor 488 (1:200) (ThermoFisher Scientific, 10 μg ml–1 verdünnt im Blockierungspuffer ). Nach dem Waschen mit D-PBS wurden die Zellen in 100 μl 2 mM EDTA-haltigem D-PBS resuspendiert und durch einen 40-μm-Filter filtriert. Die Fluoreszenzintensität einzelner Zellen wurde unter Verwendung eines Durchflusszytometers (EC800 ausgestattet mit) quantifiziert ein 488-nm-Laser, Sony). Das von Alexa Fluor 488 abgeleitete Fluoreszenzsignal wurde in einem FL1-Kanal aufgezeichnet und die Durchflusszytometriedaten wurden mit der FlowJo 10-Software (FlowJo) analysiert. Lebende Zellen wurden mit einer Vorwärtsstreuung (FS-) erfasst. Peak-Lin)-Cutoff bei der Einstellung 390, mit einem Verstärkungswert von 1,7. Für die Analyse wurden Werte der mittleren Fluoreszenzintensität von etwa 20.000 Zellen pro Probe verwendet.

Die Transfektion wurde mit einer Mischung aus 500 ng mVenus-β-Arrestin 2 und 200 ng Flag-PTH1R-Plasmiden (pro Vertiefung in einer 6-cm-Schale) durchgeführt. Nach eintägiger Inkubation wurden die transfizierten Zellen gesammelt und erneut auf einer 35-mm-Glasbodenschale mit Kollagenbeschichtung (Matsunami) ausgesät. Nach einem Tag wurde das Medium auf DMEM ohne Phenolrot und FBS (Hungerpuffer) umgestellt. Nach einer Stunde Inkubation wurden die Zellen eine Stunde lang mit Alexa-647-markiertem (1:2.000) Flag-M1-Antikörper inkubiert, einmal im Hungerpuffer gewaschen und auf das konfokale Mikroskop gestellt. Die Lebendzellbildgebung wurde mit LSM880 mit Airyscan (Zeiss) durchgeführt, ausgestattet mit einer Alpha-Plan-Apochromat-Ölimmersionslinse ×100/1,46 und ImmersolTM 518F/37 °C (444970-9010-000, Zeiss). Während der Lebendzellbildgebung wurde die Schale in einer Kammer (STXG-WSKMX-SET, TOKAI HIT) montiert, um die Inkubationsbedingungen bei 37 °C und 5 % CO2 aufrechtzuerhalten. Wir haben zweifarbige Zeitrafferbilder mit den folgenden Einstellungen aufgenommen: Zeitintervall von 5 Minuten; Gesamtzeit 35 Min. Die 200 µl Ligandenlösung in 0,01 % BSA-HBSS wurde zwischen den Zeitpunkten 1 und 2 hinzugefügt. Die erfassten Serienbilder wurden mit Zeiss ZEN 2.3 SP1 FP3 (schwarz, 64 Bit) (v.14.0.21.201) Airyscan verarbeitet. Die Co-Lokalisierungsanalyse wurde mit Fidschi (v.2.0.0-rc-69/1.52p) durchgeführt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Atomkoordinaten für den PCO371-gebundenen PTH1R-Mini-Gsβ1γ2-Nb35-Komplex wurden im PDB unter dem Zugangscode 8GW8 hinterlegt. Die zugehörigen Elektronenmikroskopiedaten wurden in der Electron Microscopy Data Bank unter dem Zugangscode EMD-34305 hinterlegt. Alle weiteren Daten werden mit diesem Dokument bereitgestellt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Referenzen herunterladen

Wir danken R. Danev und M. Kikkawa für den Aufbau der Kryo-EM-Infrastruktur; K. Ogomori für technische Unterstützung; K. Sato, S. Nakano und A. Inoue von der Tohoku-Universität für ihre Unterstützung bei der Plasmidvorbereitung und den zellbasierten GPCR-Assays; und K. Yamashita für die Modellvalidierung. Diese Arbeit wurde durch die JSPS KAKENHI-Zuschüsse JP20J21820 (K. Kobayashi), JP21H05037 (ON), JP21H04791 (AI), JP21H05113 (AI), JP18H05425 (TM), JPJSBP120213501 (AI) und JPJSBP120218801 (AI) unterstützt; JP19gm5910013, JP20gm0010004, JP20am0101095, JP22ama121038 und JP22zf0127007 (AI) von der Japan Agency for Medical Research and Development (AMED); JP22am0101115, JP22ama121002 (Unterstützungsnummer 3272), JP22ama121012 (Unterstützungsnummer 4826) und JP233fa627001 (EIN); JPMJFR215T und JPMJMS2023 (AI) von der Japan Science and Technology Agency (JST); JST CREST-Programm 20344981 (ON); Takeda Science Foundation (AI); die Uehara Memorial Foundation (AI); Tokyo Biochemical Research Foundation (AI); und Daiichi Sankyo Foundation of Life Science (AI); und ein Forschungsstipendium von Chugai Pharmaceutical (AI, TM und ON). Molekulare Grafiken und Analysen wurden mit UCSF ChimeraX 1.0 durchgeführt, das von der Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics an der University of California, San Francisco, mit Unterstützung der National Institutes of Health (R01-GM129325) und des Office of Cyber Infrastructure entwickelt wurde und Computational Biology, National Institute of Allergy and Infectious Diseases.

Atsuhiro Tomita

Aktuelle Adresse: Preferred Networks, Tokio, Japan

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Kazuhiro Kobayashi, Kouki Kawakami

Abteilung für Biowissenschaften, Graduate School of Science, Universität Tokio, Tokio, Japan

Kazuhiro Kobayashi, Tsukasa Kusakizako, Atsuhiro Tomita, Michihiro Nishimura, Kazuhiro Sawada, Hiroyuki H. Okamoto und Osamu Nureki

Graduiertenschule für Pharmazeutische Wissenschaften, Universität Tohoku, Sendai, Japan

Kouki Kawakami, Suzune Hiratsuka, Gaku Nakamura, Riku Kuwabara und Asuka Inoue

Forschungsabteilung, Chugai Pharmaceutical, Shizuoka, Japan

Hiroshi Noda, Hiroyasu Muramatsu und Masaru Shimizu

Labor für Organellenpathophysiologie, Abteilung für Integrative Biowissenschaften, Graduate School of Life Sciences, Tohoku-Universität, Sendai, Japan

Tomohiko Taguchi

Fachbereich Chemie, Graduate School of Science, Universität Chiba, Chiba, Japan

Takeshi Murata

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K. Kobayashi hat das gesamte Experiment entworfen. K. Kobayashi. KS und HHO konstruierten und reinigten die Plasmide. K. Kobayashi reinigte das Mini-Gs-Heterotrimer, Nb35 und PCO371-gebundenes PTH1R und bereitete den Komplex und die Kryo-EM-Gitter vor. K. Kobayashi, K. Kawakami, SH und HN führten die Mutationstests und -analysen durch. HM und MS führten Analysen durch und leiteten dieses Programm auf der Grundlage ihrer biologischen Fachkenntnisse. K. Kobayashi und TK sammelten Kryo-EM-Daten und K. Kobayashi verarbeitete die Kryo-EM-Daten. K. Kobayashi baute Modelle und führte Modellierungen und Verfeinerungen durch. AT entwarf das System zur Molekulardynamiksimulation. AT und K. Kobayashi führten die Molekulardynamiksimulation durch und analysierten sie. K. Kobayashi bereitete das erste Manuskript vor und K. Kobayashi, K. Kawakami, AT, TK und MN verfassten das Manuskript unter Mitwirkung aller Autoren. TK, AI, TM und ON überwachten die Forschung.

Korrespondenz mit Asuka Inoue, Takeshi Murata oder Osamu Nureki.

ON ist Mitbegründer und externer Direktor von Curreio Inc. HN, HM und MS sind Mitarbeiter von Chugai Pharmaceutical. Alle anderen Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Nature dankt Sudarshan Rajagopal und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

pH-Empfindlichkeit der GloSensor cAMP-Reaktionen von PTH1R bei Stimulation mit PTH und PCO371. Beachten Sie, dass wir den Testpuffer (siehe auch Methoden) auf den angegebenen pH-Wert eingestellt haben. Symbole und Fehlerbalken stellen den Mittelwert bzw. SEM von drei unabhängigen Experimenten dar, die jeweils doppelt durchgeführt wurden.

(a) Repräsentative mikroskopische Aufnahme aus 6.333 Bildern des PCO371–PTH1R–Gs-Datensatzes, die die Verteilung der PCO371–PTH1R–Gs-Partikel zeigt. (b) Repräsentative zweidimensionale Klassendurchschnitte, die sekundäre Strukturmerkmale anzeigen. Der Durchmesser der kreisförmigen Fenster beträgt 18 nm. (c) Datenverarbeitungsworkflow für den PCO371-PTH1R-Gs-Komplex nach der 3D-Klassifizierung. (d) Goldstandard-Fourier-Shell-Korrelationskurven (FSC), die die globale Gesamtauflösung bei 2,9 Å angeben.

(a) Kryo-EM-Dichtekarten und -modelle für PTH1R und PCO371. (b) Kreuzvalidierung jedes verfeinerten Modells unter Verwendung von zwei Halbkarten. Die Überanpassung verfeinerter Modelle wurde mit einer zuvor beschriebenen Kreuzvalidierungsmethode53 getestet.

(a) Vergleich des PCO371-PTH1R-Gs-Komplexes mit endogenen peptidgebundenen und orthosterischen chemischen Agonisten-gebundenen GPCR-Komplexen der Klasse B1. Da es keine Struktur einer an orthosterische chemische Agonisten gebundenen PTH1R-Struktur gibt, verwendeten wir LY3502970 (ein proprietärer GLP-1-Rezeptoragonist)-GLP-1R-Gs, um die Strukturen von an orthosterische chemische Agonisten gebundenen GPCRs der Klasse B1 darzustellen. Orthogonale Ansichten und Modelle zeigen PTH–PTH1R–Gs (PDB: 7VVL), PCO371–PTH1R–Gs (8GW8) und LY3502970–GLP-1R–Gs (PDB: 6XOX). Grün, PTH-gebundenes PTH1R; orange, PTH; gelbe, Mini-Gs-Ras-ähnliche Domäne; Tomate, Gβ1; Marine, Gγ2; puderblau, Nb35; violett, PCO371-gebundenes PTH1R; purpurrot, LY3502970-gebundenes GLP-1R; Himmelblau, LY3502970. Gray, PTH–PTH1R–Gs; violett, PCO371–PTH1R–Gs; rot, LY3502970–GLP-1R–Gs. Die PCO371-gebundene PTH1R-Karte zeigt im Gegensatz zu den PTH-gebundenen PTH1R- und LY3502970-gebundenen GLP-1R-Karten keine offensichtliche ligandenähnliche Dichte in der orthosterischen Tasche. (b) Schnittansichten von endogenen peptidgebundenen PTH1R- und GLP-1R-Strukturen und chemischen Agonisten-gebundenen GLP-1R-Strukturen. Grün, PTH-gebundenes PTH1R; orange, PTH; weiß, GLP-1R; gelbgrün, GLP-1; violett, PCO371-gebundenes PTH1R; purpurrot, PCO371; gelb, CHU-128-gebundenes GLP-1R; blauviolett, CHU-128; lila, Danuglipron (PF-06882961)-gebundenes GLP-1R; Khaki, PF-06882961; rot, LY3502970-gebundenes GLP-1R; Himmelblau, LY3502970. Nur PCO371 bindet innerhalb der intrazellulären Höhle, während andere Agonisten auf verschiedene Weise an die orthosterische Tasche binden.

(a) Vier aktive GPCRs der Klasse B1 (grün, PTH1R; weiß, GLP-1R; rosa, Glucagon-Rezeptor [GCGR]; lila, Corticotropin-Releasing-Faktor-Rezeptor 1 [CRF1R]) werden auf inaktive oder inaktiv-ähnliche Strukturen überlagert. (b) PTH-gebundenes PTH1R und PCO371-gebundenes PTH1R werden der ePTH-gebundenen inaktiven PTH1R-Struktur überlagert (grün, PTH-gebundenes PTH1R; orange, PTH; violett, PCO371-gebundenes PTH1R; Magenta, PCO371; grau, ePTH -gebundenes PTH1R). PCO371-gebundenes PTH1R zeigte den mäßigen Knick in TM6 (ungefähr 145°), wohingegen PTH-gebundenes PTH1R den typischen scharfen Knick in TM6 (ungefähr 90°) aufwies. (c) TM6-Winkel bestehend aus den drei Cα-Atomen der Reste I/M/V6.39, G6.50 und A/V/L6.54. (d) PCO371 stabilisiert direkt die intrazelluläre Hälfte von TM6 in der äußeren Konformation, wodurch das Volumen im inneren Hohlraum vergrößert und das Gs-Protein aktiviert wird.

(a) TMD-Region des PCO371-gebundenen PTH1R. Das Auge und das Quadrat zeigen Ansichten in (c–h) an. (b) Zentralpolare Netzwerke aus gebundenem PTH-gebundenem aktivem PTH1R (links, violett), PCO371-PTH1R (Mitte, grün) und ePTH-gebundenem inaktivem PTH1R (rechts, grau). (c–h) Überlagerte Strukturen von PTH-gebundenem PTH1R (grün), PCO371-PTH1R (violett) und ePTH-gebundenem PTH1R (grau) sind parallel zur Membran dargestellt. Vergrößerte Ansichten des aktiven PYQ-Motivs und des aktiven PxxG-Schalters (c–d und f–g). Vergrößerte Ansichten des inaktiven HETY-Motivs (e und h). (i) Überlagerte Strukturen von PCO371 (purpurrot) und ePTH-gebundenem PTH1R.

Bezogen auf Abb. 3d. (a–c) PTH1R-induzierte Gs-Aktivierung, gemessen durch den GloSensor cAMP-Akkumulationstest und Zelloberflächenexpression von WT und mutiertem PTH1R, bestimmt durch die Durchflusszytometrieanalyse. (a) Konzentrations-Reaktionskurven der GloSensor cAMP-Reaktion in WT-PTH1R- oder scheintransfizierten Zellen nach PTH- oder PCO371-Stimulation. Symbole und Fehlerbalken stellen den Mittelwert bzw. SEM von drei unabhängigen Experimenten dar, die jeweils doppelt durchgeführt wurden. (b) Zelloberflächenexpression. Symbole und Fehlerbalken stellen Mittelwert bzw. SEM dar, und Punkte zeigen einzelne Daten von vier unabhängigen Experimenten, die jeweils doppelt durchgeführt wurden. Die statistische Analyse wurde mittels einer einfaktoriellen ANOVA und anschließendem Dunnett-Test zur Mehrfachvergleichsanalyse (in Bezug auf den WT) durchgeführt. ns, kein signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen. (c) Konzentrations-Reaktionskurven der GloSensor cAMP-Reaktion von WT (gestrichelte Linien) und der Mutante (durchgezogene Linien) PTH1R auf PTH- (blau) oder PCO371- (rot) Stimulation. Symbole und Fehlerbalken stellen den Mittelwert bzw. SEM von drei unabhängigen Experimenten dar, die jeweils doppelt durchgeführt wurden.

(a) Die TMD-Strukturen von PCO371-gebundenem PTH1R (violett) und PCO371 (purpurrot) sind parallel zur Membran dargestellt. (b) Überlagerte Strukturen von PCO371-PTH1R-Gs- und Formoterol-β1AR-β-Arrestin-Komplexen, ausgerichtet auf TMs 2–5. PCO371 erleichtert die äußere Konformation des intrazellulären Teils von TM6 und kollidiert mit β-Arrestin. (c) Repräsentative Bilder der zellulären Lokalisierung von Alexa-647-markiertem PTH1R (magenta) und mVenus-fusioniertem β-Arrestin 2 (grün), bezogen auf Abb. 3g. Diese Bilder stammen aus 10–19 Bildern dieser Experimente. (d) Konzentrations-Reaktionskurven der GloSensor cAMP-Reaktion von 15 Klasse-B1-GPCRs auf endogene Peptidagonisten- (blau) oder PCO371-Stimulation (rot). Für jeden GPCR wurden die folgenden endogenen Peptidagonisten verwendet; PTH (1–34), PTH2R: Wachstumshormon-Releasing-Hormon, GHRHR; Sekretin, SCTR; Hypophysen-Adenylatzyklase-aktivierendes Polypeptid (PACAP, 1–27), VIP1R und VIP2R; PACAP (1–38), PAC1R; Glucagon, GCGR; Magenhemmendes Polypeptid, GIPR; Glucagon-ähnliches Peptid 2, GLP-2R; Glucagon-ähnliches Peptid 1, GLP-1R; Corticotropin-Releasing-Faktor, CRF1R und CRF2R; Calcitonin, CALCR; Calcitonin-Gen-verwandtes Peptid, CALRL. Alle Peptide sind vom Menschen abgeleitete Sequenzen. Symbole und Fehlerbalken stellen den Mittelwert bzw. SEM von drei unabhängigen Experimenten dar, die jeweils doppelt durchgeführt wurden. (e) Zelloberflächenexpression von WT und mutiertem PTH2R, bewertet durch Durchflusszytometrieanalyse. Symbole und Fehlerbalken stellen Mittelwert bzw. SEM dar, und Punkte zeigen einzelne Daten von vier unabhängigen Experimenten, die jeweils doppelt durchgeführt wurden. Die statistische Analyse wurde mit einem zweiseitigen T-Test durchgeführt. ns, kein signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen.

(a) TMD-Strukturen von PCO371-gebundenem PTH1R und sechs intrazellulären Liganden-gebundenen GPCRs sind parallel zur Membran oder von der intrazellulären Seite dargestellt. Violett, PCO371-gebundenes PTH1R; Magenta, PCO371; orange, Verbindung 2-gebundenes GLP-1R; blau, Verbindung 2, gelb, CC-Motiv-Chemokinrezeptor (CCR2)-RA-[R]-gebundenes CCR2; violett, CCR2-RA-[R]; gelbgrünes, cmpd2105-gebundenes CCR7; Pflaume, cmpd2105; grün, Vercirnon-gebundenes CCR6; braun, Vercirnon; puderblau, cmpd-15PA-gebundenes β2AR; Koralle, cmpd-15PA; helles Cyan, cmpd-6FA-gebundenes β2AR; Gold, cmpd-6FA. (b, c) Überlagerte Strukturen von an Verbindung 2 gebundenem GLP-1R, GLP-1-gebundenem GLP-1R, LY3502970-gebundenem GLP-1R und inaktivem GLP-1R. Weiß, GLP-1-gebundenes GLP-1R; Khaki, GLP-1; rot, LY3502970-gebundenes GLP-1R; himmelblau, LY3502970; grau, inaktives GLP-1R. Verbindung2 bindet an den intrazellulären Teil von TM6 und an Verbindung2 gebundenes GLP-1R weist die identische aktive Konformation von TM6 auf. (d) GloSensor cAMP-Reaktionen in Wildtyp (WT) PTH1R und den TM6-ersetzten Mutanten auf endogene Agonisten (PTH oder Glucagon) oder PCO371-Stimulation. Symbole und Fehlerbalken stellen den Mittelwert bzw. SEM von drei unabhängigen Experimenten dar, die jeweils doppelt durchgeführt wurden. (e) Schnittansicht von PCO371–PTH1R–Gs und vergrößerte Ansicht der PCO371-G-Protein-Schnittstelle. Die mit PCO371 interagierende Gαs-Region ist orange gefärbt. (f) Sequenzausrichtung des C-terminalen Hakens von Gα-Proteinen.

(a) Eine Querschnittsansicht des PCO371-gebundenen PTH1R. (b) Eine vergrößerte Ansicht der überlagerten Struktur von PCO371-gebundenem PTH1R (lila), GCG-gebundenem GCGR (orange) und GIP-gebundenem GIPR (grau). (c) Struktureller Vergleich von N5.50 von PCO371-unempfindlichen Rezeptoren und PCO371-empfindlichen Rezeptoren, bezogen auf Abb. 4d. Violett, PCO371-gebundenes PTH1R; graue, PCO371-unempfindliche Rezeptoren; orange, PCO371-empfindliche Rezeptoren. (d) Trajektorienanalyse von drei unabhängigen Simulationen mit PCO371-gebundenem PTH1R. Die beiden oberen Felder zeigen, dass PCO371-gebundenes PTH1R eine aktive Konformation beibehält, die unserer Kryo-EM-Struktur ähnelt. Die zweite Tafel von unten zeigt den Diederwinkel von N3745,50. Die Winkel von PCO371-gebundenem PTH1R (blau) und GLP-1R (rot) sind als gestrichelte Linien dargestellt. Das untere Feld zeigt den Abstand zwischen N3745.50-ND2 und PCO371-O1, was eine stabile PCO371-Wechselwirkung mit N3745.50 in einem Zwischenzustand darstellt. (e) Deutliche Konformation von N3745.50 zwischen PCO371-gebundenem PTH1R und GLP-1-gebundenem aktivem GLP-1R (PDB-ID: 6X18). Der Diederwinkel wird mit den Winkeln N–Cα und Cβ–Cγ von N5,50 berechnet. (f) Überlagerung unserer Kryo-EM-Struktur (violett) und einer repräsentativen Momentaufnahme der 1,5 µs MD-Simulation in Lauf 2 von PCO371-gebundenem PTH1R (gelb). In der Simulation nahm der Rezeptor eine Zwischenstruktur an und PCO371 bewegte sich in Richtung TM5. (g) Vergleich unserer Kryo-EM-Struktur (violett) und einer in der Simulation beobachteten Zwischenstruktur (gelb). PCO371 interagiert in unserer Kryo-EM-Struktur nicht mit N3745.50, während es in der Simulation eine stabile Wechselwirkung mit N3745.50 erzeugt. (h) cAMP-Akkumulation von WT und N3745.50A-Mutante mit PTH und PCO371. Die N3745.50A-Mutante reduzierte selektiv die PCO371-Reaktion. Symbole und Fehlerbalken stellen Mittelwert bzw. SEM dar, und Punkte zeigen einzelne Daten von drei unabhängigen Experimenten, die jeweils doppelt durchgeführt wurden. * und ** stellen P < 0,05 bzw. 0,01 dar, mit zweifaktorieller ANOVA gefolgt von Dunnett-Test für Mehrfachvergleichsanalyse. ns, kein signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen.

(a) TMD-Strukturen von PCO371–PTH1R–Gs sind parallel zur Membran dargestellt. (b, c) Querschnitt und vergrößerte Ansichten des TMD. Der weiße gestrichelte Kreis zeigt eine intrazelluläre Ligandenbindungstasche bestehend aus TM1, TM7 und Helix8 (linkes Feld). Die weiße gestrichelte Linie zeigt den Abstand zwischen Cβ von Cys7.60 und O6 von PCO371. (d) Sequenzausrichtung der C-terminalen Region nach TM7. Das rote Feld zeigt C4627.60 von PTH1R.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Kobayashi, K., Kawakami, K., Kusakizako, T. et al. GPCR-Aktivierung der Klasse B1 durch einen intrazellulären Agonisten. Natur (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-06169-3

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Eingegangen: 26. September 2022

Angenommen: 04. Mai 2023

Veröffentlicht: 07. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-06169-3

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